ユーグレナの嫌気的二酸化炭素固定経路の生理機能解明とその物質生産への応用

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06342
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 小川 拓水 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 講師 (00580367)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 太田 大策 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (10305659)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ユーグレナ / ワックスエステル / 還元的TCA回路 / ミトコンドリア / 嫌気的代謝

Outline of Annual Research Achievements

ユーグレナは，バイオマス生産効率に優れたモデル藻類の一種である。嫌気的環境下では，貯蔵多糖パラミロンを分解代謝し，解糖系とミトコンドリア内の脂肪酸合成経路を駆動し代謝エネルギーを獲得する（ワックスエステル発酵）。このとき最終産物としてワックスエステルを合成・蓄積する。当該年度（令和2年度）は，前年度から継続して，研究目的（1）「二酸化炭素固定反応を触媒する代謝酵素の同定」および研究目的（2）「低酸素環境下で起動する二酸化炭素固定経路が担う生理機能解明」の達成を目指して研究を進めた。
当該年度は，ワックスエステル発酵の誘導過程においてミトコンドリア内で起こる代謝反応やミトコンドリア内膜を隔てた物質の出入りを精密に解析するための実験系を構築することを目標として，i) 単離ミトコンドリア調製方法の検討を行った。ユーグレナのミトコンドリア単離に関する先行研究を精査すると培地組成の改変により細胞分裂を抑制する例が多く見られた。この培地組成の改変がミトコンドリアの形態に与える影響を調べるために，生細胞のミトコンドリアを染色できるスチリル試薬であるDASPMIを用いてミトコンドリアを可視化後に蛍光顕微鏡下で観察したところ，通常培地では改変培地と比較して顆粒状ミトコンドリアの存在割合が低いことが示唆された。この培地組成の差異によるミトコンドリアの形態変化がその後の単離効率に影響を与える可能性が考えられた。並行して，ii)単離オルガネラ懸濁液中の溶存酸素濃度変化を測定するためにクラーク型酸素電極装置をセットアップした。また，iii)低酸素環境下でのワックスエステル蓄積を促進する作用を示す低分子化合物群の特徴付けを進めた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

i) 細胞をタンパク質分解酵素で処理してスフェロプラスト化し，続いて浸透圧ショックを与えて細胞を破壊し，パーコール密度勾配遠心法によりミトコンドリアを単離する方法について条件検討を進めた。通常培地で培養した細胞を材料とした場合，単離ミトコンドリアが含まれる画分において呼吸基質添加後の酸素消費量の増加は認められなかった。そこで，多量の初発試料を確保するために，培養スケールを10倍に拡大した。また，多量の試料を迅速に処理するために圧力式細胞破砕器の導入準備を進めた。先行研究で頻繁に用いられてきた培地組成改変を伴う単離方法を通常培地で培養した細胞に直接適用することは困難であったため，単離ミトコンドリアを用いた仮説検証のための実験に着手するには至らなかった。ii) クラーク型酸素電極装置のセットアップを完了し，常時稼働させている。単離ミトコンドリアの代謝活性評価に呼吸活性を用いることが可能となった。iii) 低酸素環境下でのワックスエステル蓄積を促進する作用を示す低分子化合物群のうち数種類の化合物をユーグレナ生細胞に処理すると光照射下での酸素発生量が減少した。このことから，光合成の炭素代謝が活性化合物の作用点の一つである可能性が示唆された。活性化合物の作用点の解明は当初の研究計画には含まれないが，ワックスエステル生合成と葉緑体の炭素代謝との関連性について重要な知見が得られる可能性がある。

Strategy for Future Research Activity

単離ミトコンドリア調製時の細胞破砕方法として，多量の試料を迅速に処理することができる圧力式細胞破砕器の導入を予定している。圧力式細胞破砕器のセットアップ完了後に，細胞濃度，破砕バッファーの種類，破砕時の圧力条件，破砕時間について条件検討を進め，酸素電極装置を用いた呼吸活性測定により単離効率を評価する。膜構造の完全性の評価はカルセイン染色法とテトラメチルローダミンメチルエステル染色法により行う。他のオルガネラの混入状況の評価は，オルガネラマーカー抗体を用いたウエスタンブロッティングにより行う。単離ミトコンドリアを用いてワックスエステル発酵の誘導過程においてミトコンドリア内で起こる代謝反応やミトコンドリア内膜を隔てた物質の出入りを精密に解析するための実験系を構築し，作業仮説の検証を進める。
当該年度の研究により，活性化合物が光合成の炭素代謝に作用する可能性を示唆する結果が得られた。単離葉緑体を用いて活性化合物の作用点の検証を進める。

Causes of Carryover

研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが，研究計画に変更はなく，前年度の研究費も含め，当初の予定通りの計画を進めていく。