2020 Fiscal Year Research-status Report
Attempts to perform genome modification towards donor cells for improving SCNT efficiency in pigs
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19K06372
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 総合科学域総合研究学系, 教授 (30287099)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三好 和睦 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (70363611)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 体細胞核移植 / 初期化 / 遺伝子改変 / クローンブタ / DNAメチル化転移酵素1 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生物医学研究に重要な遺伝子改変ブタの作製は、マウスの場合と異なり、遺伝子改変された細胞（主に胎仔性繊維芽細胞）をドナーとする体細胞核移植（SCNT）経由のクローンブタ作製が今でも主流である。しかし、SCNT効率は極端に低い。通常、ドナー細胞の核はSCNT直後、卵細胞質内の初期化因子により遺伝子発現様式が幼弱期のものにリセットされる。しかし、ドナー核はこのようなリセットへの対応が不十分なため、多くのSCNT胚は以降の発生に異常をきたす。本申請では、強制的に「ドナー細胞の幼弱化（あるいは初期化）」を行い、SCNT後、胚盤胞への発生率向上（いわゆる、SCNT効率改善）がなされるかを検討し、最終的に効率的な遺伝子改変クローンブタ作成を目指す。最近、ヒストンH3K4, H3K9のメチル化がSCNT効率を下げる要因という報告が出された。そこで、既に作成済みの遺伝子改変細胞（未分化細胞マーカー遺伝子OCT3/4のpromoterに駆動される緑蛍光蛋白遺伝子（EGFP）を内蔵）をテスト細胞に用い、当該細胞をドナーとするSCNTを行なった。すると、ドナー核が初期化され、胚は緑蛍光を微弱ながら発した。これはドナー核由来の胚細胞が未分化状態になり、未分化細胞で特異的に発現するOCT3/4遺伝子（promoter）が発動したからと考えられる。この細胞にヒストン遺伝子群のメチル化を促すDNAメチル化転移酵素1（DNMT1）遺伝子をゲノム編集で破壊。すると、当該細胞は緑蛍光を発するようになった。また、未分化マーカーであるALP発現も増大。この細胞をドナーとするSCNTを行うと、胚盤胞での緑蛍光が増大。発生率も2倍ほど改善された。以上から、①DNMT1阻害により、細胞は高度に初期化される。②SCNT胚作成におけるDNMT1遺伝子破壊の有効性などが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
テスト細胞を用いた遺伝子工学的処置によるSCNT改善効果についての検証を目指した。特に、H3K4, H3K9のメチル化を促すDNAメチル化転移酵素1（DNMT1）遺伝子の破壊によるH3K4, H3K9のメチル化解除、それによるドナー核の初期化の亢進の可能性を検討した。具体的には、既に作成済みの遺伝子改変ブタ繊維芽細胞株（未分化細胞マーカーとされるOCT3/4遺伝子の promoterに駆動される緑蛍光蛋白遺伝子（EGFP）発現ユニットを内蔵）にブタDNMT1遺伝子を標的としたCRISPR/Cas9系のsingle guide RNAとCas9蛋白とのmixtureを電気穿孔により導入。この場合、我々が独自に開発したnegative selection系をかませ、最終的に、生じた細胞コロニー（DNMT1遺伝子が完全に破壊）を拾った。これらコロニーでは、親株では見られない緑蛍光の発現が見られた。これは、内在性OCT3/4遺伝子が活性化され、初期化状態になったことを示唆する。実際、他の未分化マーカーalkaline phosphatase（ALP）の発現も亢進していた。但し、細胞形態は親株と同等。ゲノム編集していない親株をドナーとするSCNTの場合、発生胚盤胞は、その内部細胞塊において緑蛍光を微弱ながら発するが、ゲノム編集処理株をドナーとするSCNTの場合、SCNT由来の胚盤胞は明確な緑蛍光を発した。発生率も2倍ほど改善された。以上から、①DNMT1阻害により、細胞は高度に初期化される。②SCNT胚作成におけるDNMT1遺伝子破壊の有効性などが確認された。現在、ゲノム編集処理株がiPS細胞に近いポテンシャルを示す可能性があるため、当該細胞を数個単為発生胚（4-cell stage）の囲卵くうに顕微注入し、それらが胚盤胞形成に寄与するかどうか（キメラ形成能があるかどうか）を検討中。
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| Strategy for Future Research Activity |
H3K4, H3K9の脱メチル化を促すには、ヒストン脱メチル化酵素をコードするヒトKDM4D遺伝子を過剰発現させる手段もある。そこで、KDM4D発現ベクター（pKDM4D；OriGene社）を基にKDM4D mRNA合成を行い、得られたmRNAをOCT3/4 promoter-EGFPを搭載した遺伝子改変ブタ繊維芽細胞株（m4と呼ぶ）をドナーとするSCNT胚に細胞質顕微注入あるいは当該試薬を含む液にて電気穿孔に付す。発生胚盤胞において緑蛍光の発現増大が見られるかを観察する。明確な緑蛍光が見られた場合、KDM4D発現によりドナー核での初期化が加速したと考えられる。これまでの結果から、ドナー細胞でのDNMT1遺伝子の破壊がSCNT効率を高める、という結果であったので、m4を用いたSCNT胚にKDM4D mRNAを電気穿孔により導入させた場合、SCNT効率が向上するか（いわゆる、相乗効果）、緑蛍光発現が増大するかどうかも検討する。一方、遺伝子発現プロファイルを網羅的に検討するため、「DNMT1遺伝子の破壊株をドナーとするSCNT胚 vs. intactな親株をドナーとするSCNT胚 or単為発生胚」、「DNMT1遺伝子の破壊株をドナーとするSCNT胚にKDM4D mRNAを導入した胚vs. DNMT1遺伝子の破壊株をドナーとするSCNT胚」の間でRNA seq.解析に付す。DNMT1遺伝子の破壊 + KDM4D mRNA発現によりSCNT胚の遺伝子発現プロファイルが単為発生胚のそれに近似することが期待される。
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| Causes of Carryover |
2021年度は成果について論文を作成し、投稿する予定である。そのため、論文投稿に関する費用分を次年度使用額として翌年度分にもちこすことにした。
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[Journal Article] Drug-induced naive iPS cells exhibit better performance than primed iPS cells with respect to the ability to differentiate into pancreatic β-cell lineage2020
Author(s)
Kiyokawa Y, Sato M, Noguchi H, Inada E, Iwase Y, Kubota N, Sawami T, Terunuma M, Maeda T, Hayasaki H, Saitoh I
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Journal Title
Journal of Clinical Medicine
Volume: 9
Pages: E2838
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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