2019 Fiscal Year Research-status Report

オートファジーの活性化に着目したラクトフェリンの新規機能の解明

Research Project

Project/Area Number	19K06375
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	相澤修日本大学, 生物資源科学部, 講師 (10645899)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ラクトフェリン / オートファジー / 腸管上皮細胞
Outline of Annual Research Achievements	母乳には新生児の健やかな発達に必要な栄養成分に加えて、未熟な免疫機能を補う生理活性物質が多く含有されている。ラクトフェリンは、母乳中に見出された鉄結合性の糖タンパク質である。母乳とともに新生児に摂取されたラクトフェリンは、腸管内において生育に鉄を必要とする細菌の増殖を抑制する作用を持つ。このことから、ラクトフェリンは、免疫系が未熟な新生児における生体防御因子として機能する。加えて、ラクトフェリンには、腸管上皮細胞に対する増殖促進効果や炎症性サイトカインレベルの調節効果などが報告されており、腸管組織に対して直接的に作用することも予想されている。しかしながら、上記のラクトフェリンの生物学的機能を仲介する分子機構は不明である。研究代表者は、生体内におけるラクトフェリンの機能発現メカニズムを探索する過程において、ラクトフェリンが細胞内の大規模分解システムであるオートファジーを活性化させることを発見した。本研究では、腸管組織におけるラクトフェリンの有益な機能の発現におけるオートファジー活性化の役割を明らかにすることを目的とする。今年度は、ラット由来培養腸管上皮細胞モデルIEC-6を用いた実験系により、ラクトフェリンが腸管上皮細胞においてもオートファジーを活性化するか解析した。その結果、申請者がマウス胎仔線維芽細胞株NIH/3T3で行った先行研究と同様に、IEC-6においてもオートファジーフラックスの増加が確認された。また、IEC-6にはラクトフェリン受容体分子が高レベルで発現していることも確認された。さらに、マウス腸管組織におけるラクトフェリン受容体分子の発現を解析した結果、領域特異的な発現パターンを示すことが明らかとなった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 培養腸管上皮細胞モデルIEC-6において、NIH/3T3で行った先行研究と同様にラクトフェリン処理によりオートファジー活性化マーカーであるLC3-IIタンパク質量が増加することを確認した。このことから、当初の計画通り、腸管上皮細胞においてもラクトフェリンがオートファジーを活性化させることを見出した。また、IEC-6におけるラクトフェリン受容体分子の発現を確認しており、これらを標的としたsiRNAによる発現抑制実験に関してもすでに着手済みである。さらに、マウス腸管組織におけるラクトフェリン受容体分子の発現パターンが明らかとなったことは、今後の生体を用いた研究の推進において重要な成果であると考えられる。一方で、阻害剤を用いた細胞内シグナル伝達分子の同定に関する研究は、使用した阻害剤の細胞毒性が予想を上回ったことや、特異性の問題などにより、当初の計画よりやや遅れている。
Strategy for Future Research Activity	令和2年度は、第一に前年度に達成できなかった阻害剤を用いた細胞内シグナル伝達分子の同定を行う。阻害剤による実験が前年度と同様に難しいと判断された場合は、siRNAによる標的分子の発現抑制実験へと速やかに切り替え、その影響を解析する。また、第二としてラクトフェリンによるオートファジー活性化におけるラクトフェリン受容体分子の役割について、培養腸管上皮細胞モデルを用いた発現抑制実験などによりさらに深く追究する。加えて、前年度にマウス腸管組織におけるラクトフェリン受容体分子の発現パターンが明らかとなり、標的となる腸管組織の部位が明らかになったことから、生体におけるラクトフェリンによるオートファジー活性化の存在およびその役割についてアプローチする。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由は、令和元年度に計画していた培養腸管上皮細胞モデルを用いた細胞内シグナル伝達分子の同定に関する研究が、使用した阻害剤の細胞毒性が予想を上回ったことや、特異性などの問題により、当初の計画通り進行しなかったためである。次年度使用額は、計画通りに進行しなかった上記研究のために主に使用する予定である。すなわち、上記研究に関連する細胞生物学・分子生物学的解析に用いる消耗品やプラスチック器具類やガラス器具類などを購入する予定である。実験設備は整っているため、設備備品の購入予定はない。