2019 Fiscal Year Research-status Report

鶏卵由来ペプチドのアミロイド線維形成阻止機構の解明と疾患予防効果の検証

Research Project

Project/Area Number	19K06376
Research Institution	Kyushu Nutrition Welfare University
Principal Investigator	杉元康志九州栄養福祉大学, 食物栄養学部, 教授 (10100736)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	日下部宜宏九州大学, 農学研究院, 教授 (30253595) 阿部義人九州大学, 薬学研究院, 准教授 (60315091)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	アミロイドβ / アミロイド線維形成機構 / リゾチーム / 抗アミロイド病 / 卵黄ペプチド / 抗糖尿病 / 糖分解酵素阻害 / 鶏卵卵殻膜ペプチド
Outline of Annual Research Achievements	高齢化社会を迎え、生活習慣病をはじめ多くの疾病が社会問題となり、その対策が急がれている中、認知症をはじめとするアミロイド病や糖尿病を予防出来る食品素材・鶏卵タンパク質由来ペプチドの効果が期待されている。 2020年度では卵白、卵黄、カラザ、卵殻膜のそれぞれのタンパク質の分解物についてアミロイドβおよびリゾチームのアミロイド線維化の阻止効果を調べた。アミロイドβおよびリゾチームの線維化阻止にはカラザペプチドが最も効果的で、アミロイドβの凝集・線維化を強く阻害した。卵殻膜や卵白にも見られた。卵殻膜ペプチドが卵殻膜タンパク質分解物をHPLCで機能ペプチドを分画した。本ペプチドはまだいくつかのペプチドの混合物であったためさらなる分画法によって精製を試みている。また、線維を分解するプロテアーゼ、ヒトネプリライシンをカイコ・バキュロス発現系で調製することが出来た。今後、このプロテアーゼによるアミロイド線維分解を促進するペプチドを探索する。鶏卵ペプチドの抗糖尿病効果についてはヒトアミラーゼ及びすい臓アミラーゼを強く阻害するペプチドを卵黄から見出した。卵黄タンパク質分解物をHPLCで機能ペプチドを分画した。ペプチドの同定を行っている。ブタα-グルコシダーゼおよび酵母インベルターゼについて鶏卵ペプチドの阻害効果を調べた。いずれの酵素に対して卵黄および卵殻膜ペプチドが効果を示した。卵黄ペプチドは糖の分解・吸収を抑制することで抗糖尿病効果が期待される。ヒトのマルターゼおよびスクラーゼをカイコ・バキュロス系で発現を試みている。ポリオール経路の阻害実験においてアルドース還元酵素およびイノシトール脱水酵素を阻害するペプチドを卵殻膜およびカラザ分解物から認めた。卵殻膜ペプチドには糖尿病で問題となるポリオール経路を抑制する効果が期待された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究のメインである鶏卵ペプチドのアミロイド線維形成阻止効果および糖尿病関連酵素阻害作用においては概ね進んでいる。また、活性ペプチドについての分離・同定を進めているが、同定までは至ってない。それは鶏卵タンパク質由来のペプチドが多くの多種のペプチドからなっており、機能ペプチドを単離するためにはいくつかのクロマトグラフィーを行わなければならない。候補のペプチドが解れば合成ペプチドで機能の解析を行う。アミロイドの線維形成機構の解明には化学摂動法およびSTD-NMR法で進めているが、ペプチドとアミロイド線維コア領域との相互作用がやや曖昧で、明確な結論に至ってない。アミロイド線維を特異的に分解するネプリライシンおよびポリオール経路の重要な酵素であるアルドース還元酵素についてはカイコ・バキュロス発現系で成功し、ネプリライシンを賦活化するあるいはアルドース還元酵素を阻害する鶏卵ペプチドが探索出来、アミロイド病の予防・改善や糖尿病における糖修飾を抑制することが期待される。一方、糖分解における重要なマルターゼやスクラーゼは膜たんぱく質で分子量が20万以上と大きく、クローニングは出来たが、なかなかタンパクの発現までは至ってない。高発現カイコを使って行っており、成功すれば大きな成果となる。
Strategy for Future Research Activity	鶏卵ペプチドのアミロイド病あるいは糖尿病の予防・治療に有用であることを認めた。アミロイド病に関してはアミロイドβペプチドの凝集阻害を卵殻ペプチドが顕著に示すが、ペプチドの同定に至ってない。本年度以降、各種クロマトグラフィーでペプチドを単離し、質量分析等でペプチドの配列を決定する。抗糖尿病に関しては、卵黄ペプチドがαアミラーゼおよびαグリコシダーゼを阻害することから同様に、各種クロマトグラフィーでペプチドを単離し、質量分析等でペプチドの配列を決定する。また、マルターゼとスクラーゼについてはカイコ・バキュロスタンパク発現系での研究を進め、両酵素の調製を急ぐ。糖分解・吸収に関わる酵素を阻害できるペプチドを同定できれば食材として抗糖尿病剤として有用になる。アミロイド線維の形成には線維形成コア領域が重要に関与し、構造が重要である。カラザペプチドのリゾチームの凝集阻止効果としてリゾチームのTrp（Tyr）残基との相互作用である可能性があり、化学摂動法およびSTD-NMR法によって実証していく。アミロイドβについてもカラザペプチドと凝集コアアミノ酸域について分析していく。また、アミロイド線維を特異的に分解するネプリライシンをクローニングによりタンパク質を得たことからをこれらの酵素を活性化する鶏卵ペプチドの探索を行う。鶏卵ペプチドの抗糖尿病効果としてはポリオール経路の抑制に関与できるものを分離・同定していく。アルドース還元酵素を大量調製できたのでペプチドの作用機作についても調べる。
Causes of Carryover	ペプチド合成を行う予定であったが、ペプチドの同定が出来なかったため、次年度に繰り越した。