血友病発症犬におけるフコイダンの血小板及び凝固活性化を介した出血抑制機序の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06381
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 鬼頭 克也 岐阜大学, 応用生物科学部, 教授 (80270974)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: フコイダン / 血小板凝集 / チロシンキナーゼ依存性経路 / G蛋白質結合受容体 / オキナワモズク / 犬 / 分子量

Outline of Annual Research Achievements

オキナワモズク由来の高分子量（約30万）フコイダン（50 μg/mL）による健康犬血小板の凝集は、Src family kinase (SFK) 阻害剤のPP2を前処置すると著しく減弱した。ついでspleen tyrosine kinase (Syk) 阻害剤のOXSI-2またはGo6976を前処置した場合も、フコイダンによる血小板凝集は著しく減弱した。さらにホスホリパ一ゼC（PLC）選択的阻害剤のU73122を前処置した場合にも血小板凝集は著しく減弱した。これらの結果から高分子量フコイダンによる犬の血小板凝集には、非受容体型チロシンキナーゼSFKおよびSykと、さらにその下流にあるPLCが活性化するチロシンキナーゼ依存性経路が関与していることが明らかになった。つぎにフコイダンが凝集を惹起する際の血小板膜上の受容体を同定するため、FcRIIAを阻害するIV.3 抗体（FcγRII/CD32抗体）、ヒト血小板のコラーゲン受容体GPⅥアンタゴニストでC-type lectin receptor 2（CLEC-2）受容体には作用しないヒノキチオールをそれぞれ処理したところ、いずれも犬の血小板凝集に変化を認めず、現在までに受容体を同定するには至っていない。
一方、中分子量（約5万）フコイダンも健康犬の血小板を濃度依存性（0.5、１、5、10および50 μg/mL）に凝集し、その活性は5 μg/mLでピークに達した。また5 μg/mLのフコイダンによる犬の血小板凝集はPP2の前処置により減弱しなかったが、選択的Gq/11阻害剤のYM-254890で処置した場合には著しく減弱した。したがって高分子量と中分子量フコイダンでは血小板凝集機序が異なることが示唆された。また中分子量フコイダンを血友病罹患犬に経口投与した場合、止血機能改善効果は高分子量による場合よりも弱く、持続期間も短かった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

血小板の凝集機序に関する研究報告の大多数は、ヒトやマウスの血小板を用いて行われており、犬の血小板を用いた報告は少ない。本研究課題は、ヒトやマウスの血小板と犬の血小板が基本的に同じ機構で活性化するとの仮説のもとで、ヒトやマウスでの研究手法を応用して、フコイダンによる犬の血小板活性化機構の解明を目指したものである。その結果、高分子量フコイダンがチロシンキナーゼ依存性経路を介して犬の血小板を活性化することを解明することができたが、一方、犬の血小板膜上のフコイダンを認識する受容体の同定には、ヒトやマウスで用いられた手法は応用できないことが分かった。そこで、高分子量フコイダンが血小板凝集を惹起する際の受容体を同定するために活用できる試薬等、あらたな手法について検討しているところである。
また、フコイダンの分子量によって血小板の凝集機序が異なることが分かったので、現在、中分子量フコイダンによる血小板凝集機序について、特にG蛋白質共役受容体経路に焦点をあてて実験を継続しているところである。

Strategy for Future Research Activity

高分子量フコイダンを認識する血小板受容体を同定するとともに、中分子量フコイダンによる凝集機序を解明する。また、フコイダン分子量による活性化機序の違いと中分子量フコイダンでは血友病罹患犬に対する止血機能改善効果が減弱した関係についても検討する予定である。最近、マウス血小板では高濃度のフコイダンはGPⅥを介して，低濃度はCLEC-2とPEAR-1を介して凝集すること、一方、ヒトの血小板ではフコイダンの硫酸化度によってPEAR1受容体およびGP1Bα受容体を介して凝集活性化することが報告されたので、フコイダンの濃度ならびにフコイダンの硫酸化度の違いによって、フコイダンを認識する血小板受容体が異なるか否かの検討も加える予定である。
つぎに、活性化血小板による凝固能促進（プロコアグラント）を評価するために、血小板由来マイクロパーティクル（PDMP）量と血小板膜リン脂質の発現をフローサイトメトリー法により測定する予定である。さらにフコイダンによる組織因子経路インヒビター（TFPI）阻害を証明するとともに、血小板由来のTFPIがこれに関与しているか検索する手法を構築することを目指す。

Causes of Carryover

フコイダンによる血小板シグナル伝達機構を解明するため、ならびにフコイダンを認識する受容体を探索するために、ヒトやマウスでの研究手法（試薬など）を応用してきたが、犬の血小板には必ずしも適応しないことが分かったため、それに係る予算の一部を次年度以降に繰り越した。その残金は当該機序を解明するために使用する予定である。