2019 Fiscal Year Research-status Report
ゾウリムシバイオリソースを活用したレジオネラエフェクターの網羅的機能解析
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19K06383
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
渡邉 健太 山口大学, 共同獣医学部, 助教 (20582208)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | レジオネラ / ゾウリムシ / 共生 / エフェクター / 原生生物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、未だ全貌が明らかになっていないレジオネラのエフェクターについて、その詳細な機能と存在意義を解明することを最終的な目的としている。レジオネラを対象とした研究は広く世界中で行われており、マクロファージなどの哺乳類培養細胞を用いた感染実験が多用されている。しかし、こうした既存の手法では、膨大なレジオネラのエフェクターが個々にどのような機能を持ち、菌の細胞内増殖や病原性にどの程度関与しているのかについて部分的にしか解明できていない。そこで本研究では、レジオネラが環境中においては原生生物と共生関係を構築するという特徴に着目し、その共生機構に関わるエフェクターの機能からアプローチするという新しい手法により、解析を進めている。
レジオネラの原生生物宿主としてはゾウリムシを採用している。ゾウリムシのナショナルバイオリソースプロジェクトから性状の異なる株を複数取得し、これを用いたレジオネラの感染実験モデルを構築した。またレジオネラについてはヒト臨床由来株に加え、環境中から複数の野外分離株を取得した。これらを実験の材料とした共生モデルを用いることで、菌側の共生因子の同定や、あるいは共生メカニズムの解析が可能であることは、これまでの我々の研究により実証済みである。
レジオネラについては、報告されているエフェクターの数が極めて膨大であることから、その全ての種類がゾウリムシとの共生に関与しているとは考えにくい。そこで、まずはこれらエフェクターを菌対外に分泌するのに必須であるIV型分泌装置の機能欠損株を作製し、その後に、個別のエフェクターについて原生生物宿主との共生に関与すると予想されるものについて絞り込みを行い、同様に欠損株を作製する。最終的に、共生に関与するエフェクターを同定し、それらが哺乳類細胞への感染や細胞内寄生においてはどのように作用するのかを検討する計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに、臨床分離株と環境分離株の性状が異なる複数のレジオネラを親株として、IV型分泌機構のコンポーネント分子とされるDotA、 DotO、 DotHなどの欠損株をホモロガスリコンビネーション法により作製した。これらの欠損株は、マクロファージ細胞内での増殖能が低下し非病原性となることが知られている。そこで作製した変異株を用いてマクロファージ系細胞への感染実験を行ったところ、既存の報告通りに細胞内増殖が低下しており、欠損株が正しく確立されていることが確認できた。また、これら欠損株のGFP遺伝子導入株や、欠損遺伝子の相補株も同時に作製しており、次の段階の実験で利用可能な状況ができている。具体的には、ゾウリムシを用いた感染実験に供試し、細胞内菌数や細胞内での局在を解析することで、親株と比較した時に共生能がどのように変化したのかを評価する。
また、別のアプローチとして、共生に関与するレジオネラエフェクターの網羅的な探索法の確立を行っている。前述の通り、候補となるレジオネラエフェクターの数が極めて膨大であることを鑑み、トランスポゾンを用いたランダムミューテーション法を応用することを想定している。この手法により、ゾウリムシとの共生能が変化した株を容易に選別するスクリーニング実験法を確立させ、共生に関与するエフェクターの効率的な探索を行う。レジオネラで使用できるトランスポゾンやランダムミューテーション法の条件検討等、予備的な実験は完了しており、本格的なランダム変異株の作製を開始している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに作製したIV型分泌機構の欠損株を用いたゾウリムシへの感染実験を行い、共生の可否を中心とした性状の変化を確認する実験を行う。当初の想定通り、共生の成立が認められなくなったり、あるいは共生率の減弱が認められたレジオネラ株が得られた場合、より多くの宿主ゾウリムシ株を用いて同様に感染実験を行い、共生に与える影響の株間での差異を検討する。ゾウリムシはナショナルバイオリソースプロジェクトから数百の性状が異なる株を安定的に入手することが可能であるため、この利点を最大限に生かして研究を進める。これにより、未だ不明な部分が多い宿主側の共生因子についても解析が可能となると考える。
また、個別のレジオネラエフェクター機能に着目した解析も並行して進める。ゾウリムシとの共生に影響が認められる欠損株を同定し、そのエフェクターの機能を分子生物学的に解明する。アメーバやテトラヒメナなど他の原生生物宿主への感染時における機能が既に報告されているエフェクターであれば、そうした既知の情報を利用し、逆に他の宿主生物での機能が明らかになっていない分子であれば、ゾウリムシで認められた機能の汎用性を確認するために、他の原生生物宿主を用いた感染実験を行う計画である。最終的には、マクロファージ細胞などの哺乳類細胞を用いた解析に発展させ、共生関連因子からレジオネラの病原性を評価するシステムを構築することで、新規病原因子の同定を目指す。これにより、レジオネラの感染防御法や治療法の確立につながるような新しい知見が得られると期待できる。
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