2019 Fiscal Year Research-status Report
Possibility of tick-derived unknown virus infection to animals-Analisis of Togotovirus pathogenisity to animals
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19K06394
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
前田 秋彦 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (70333359)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | トゴトウイルス / マダニ媒介ウイルス / オルソミクソウイルス / 病原性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2013年に京都市で捕獲したマダニから、日本では未確認であったトゴトウイルス（THOV）のHl-Kamigamo-25株を分離した。本ウイルスの自然界での感染環は不明であり、病原性についても不明である。そこで本研究では、THOVがマウスやハムスター等の実験動物に感染し、如何に病態を形成するのかについて明らかにすることを目的とした。本課題研究の初年度である本年度は、(1)実験動物のマウスやハムスターへのTHOVの感染実験を行った。BALB/c、C57BL/6およびICRの3系統のマウスにTHOVを接種してもマウスは顕著な病態変化は認められなかった。一方、シリアンハムスターに接種したところ出血性の病態を示し、感染後数日で斃死した。斃死したハムスターについて、血液学的・病理組織学的・免疫学的解析を行い、その成果の一部を「ハムスターのトゴトウイルス感染に伴う病態発現の解析」（発表１）および「ハムスターのトゴトウイルス感染に伴う病態発現の解析」 (発表3)で報告した。また、THOVに非感受性であったBALB/cマウスを用いてウイルスを20回継代したところ、BALB/cマウスに致死性を示すウイルス（MA-THOV）を分離し、病理学的および遺伝学的に解析した。その成果の一部を「トゴトウイルスのマウスへの馴化」（発表2および発表4)、「マウスに馴化したトゴトウイルスはBALB/cマウスに致死性を示す」 (発表5)、「マウスに馴化したトゴトウイルスはBALB/cマウスに致死的病態を示す」 (発表7)として学会で発表した。また、ハムスター由来細胞における持続感染細胞からTHOVの変異株（P-THOV）の作製について検討し、その成果の一部を「CHO細胞におけるトゴトウイルス持続感染の解析」 (発表6)および「トゴトウイルスのCHO-K1細胞における持続感染」（発表8）として学会で発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度、予定していた研究は概ね順調に遂行できた。実験用マウスのBALB/c や C57BL/6、ICRおよびシリアンハムスターに THOV を接種し、その感染性と病原性を確認した。マウスに THOV を高ウイルス価で感染したが感染期間の2ヶ月間に顕著な病態変化を示さなかった。一方、シリアンハムスターに同ウイルス価の THOV を接種すると、感染後3日目に出血性の症状を呈して斃死した。本ウイルスの 50% 致死量は 0.2 であった。また、ハムスターでは THOV に対する感受性に雌雄差は認められなかった。THOV 感染後、腹水の貯留や各臓器における出血、肝臓病変が顕著であったため、血液性状の変化を観察したところ、肝機能および腎機能の顕著な異常、血液凝固系の異常が確認された。また、各臓器における炎症性サイトカイン遺伝子の発現変動を解析したところ、インターフェロンγ等の発現が抑制されており、感染初期における抗ウイルス応答が抑制されている可能性が示唆された。また、THOV を継代培養することにより非感染性宿主であるマウスに対して病原性を示すウイルスが産生（あるいは選択）される可能性について検討した。THOVに非感受性のBALB/cマウス肝臓乳剤を用いて、THOVをマウスで20代継代したところ、マウスに致死性を示す MA-THOV を分離することが出来た。MA-THOVのBALB/cマウスにおける病原性は、THOV野生株のハムスターに対する病原性に類似していた。さらに、THOVの病原性を解明するために、ウイルスの持続感染による変異体の作製をおこなった。THOVをハムスター卵巣細胞に由来する CHO-K1 細胞お用いて連続継代培養したところ、継代40回まで周期的なウイルス産生が認められ、持続感染由来のTHOV変異体、P-THOV を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度（平成31年/令和元年）の研究において、Vero E6細胞を用いて3回の盲継代によりマダニから分離したTHOVは、マウスには顕著な病変を示さないがハムスターでは出血性の致死的感染を引き起こすことを示した。また THOV に非感染性のマウスにおいて継代することによりマウスに致死性を示す MA-THOV を分離するとともに、ハムスター由来 CHO-K1細胞の THOV持続感染細胞から P-THOVを分離した。今後は、これらTHOVおよび、その変異体であるMA-THOV、P-THOVを用いて、THOV の動物への病原性発現のメカニズムを詳細に検討する。まず、分離した MA- および P-THOV をクローン化し、各クローンと親株である THOV の遺伝子配列を比較解析する。また、各クローンのマウスおよびハムスターに感染させ、その病原性をウイルス学的・免疫学的・分子生物学的に解析する。以上の研究結果から、THOV の各種動物における病原性を決定する遺伝子領域を推定する。推定した THOV の病原性関連遺伝子領域の信頼性を評価するため、当該領域に変異を親株である THOV のゲノムに導入した THOV 変異体や、あるいはウイルスの転写・複製・翻訳活性を検討するミニゲノム発現系を開発する。野生型の THOV についてのミニゲノム発現系については、以前の研究により確立しており、実験系としての鋳型は既に整っている。次年度（令和2年度）は、まず MA-THOV と P-THOV のクローン化を行い、得られた変異株の遺伝的解析を行うとともに、ウイルスの感染病理学的解析を行う。さらに、THOV 感染の病態形成の原因遺伝子領域の解明のための THOV ミニゲノム発現系の構築と組換えウイルス発現系の構築について準備する。
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| Causes of Carryover |
本年度に予定していた研究計画が順調に推移したため、計画していた使用動物数や研究試薬などの消耗品の購入費を抑えることができた。そこで、次年度に計画している研究に次年度申請分と合わせて、本年度の残額分も使用する。次年度に計画する分子生物学的手法を用いた実験には比較的高価な酵素類やキット類を使用するため、本年度の残額も有効に活用できるものと考えている。
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