2021 Fiscal Year Research-status Report
Possibility of tick-derived unknown virus infection to animals-Analisis of Togotovirus pathogenisity to animals
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19K06394
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
前田 秋彦 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (70333359)
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2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マダニ媒介性感染症 / トゴトウイルス / 病原性 / 野生動物 / マダニ保有状況調査 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
京都市に生息するマダニから分離したトゴトウイルスHl-Kamigamo-25株（THOV）の①マウス馴化株（MA-THOV）クローンを作製し、そのウイルス学的性状を解析するとともに、マウスにおける病原性を解析した。また、②京都市の山林におけるマダニのTHOV保有状況について調査した。①本研究課題の初年度の研究で、THOVの野生株（WT-THOV）は、マウスには病原性を示さなかった。そこで、WT-THOVマウスで継代培養することでMA-THOVを作製した。MA-THOVをマウスに接種すると、感染後5～7日に斃死した。肉眼病理所見では、皮下や肺、肝臓など多臓器に出血が認められ、腹水の貯蔵も認められた。組織病理学的には、主に肝臓と脾臓において広範なアポトーシスとネクローシス像が観察された。次に、WT-とMA-THOVのクローンを、培養細胞を用いて分離した。それぞれのクローンの遺伝子配列を決定し、比較解析したところ、ウイルスの膜蛋白質であるGP（ウイルスの細胞への接着に作用）の２箇所とRNA合成酵素の1つであるPB2（ウイルスのゲノム複製に作用）の１箇所に変異が認められた。各ウイルスのクローンをマウスに接種し、それらの病原性を比較解析したところ、それぞれの親株と同様であった。これらの結果は、同定されたウイルスゲノム上の３箇所の変異のいずれかがマウスにおける病原性に関与することを強く示唆している。②京都市内で本年度に捕獲したマダニ（当該地の優占種であるフタトゲチマダニとキチマダニ）におけるTHOV保有状況を、THOVに特異的なPCRプライマーを用いたRT-PCRにより調査したところ、約40％であった。2018年度におこなった調査結果（約1％）に比べ非常に高く、詳細に検討する必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究申請時の研究案では、マダニ由来の未知ウイルス動物に感染するかどうかを①実験的に証明するとともに、②自然界でのマダニや動物における感染状況を調査し実証することを目的とした。①実際、京都市のマダニから分離したTHOV（WT-THOV）をゴールデンハムスターに実験感染させると、多臓器における出血をともなう肝炎症状を呈し、致死に至ることを明らかにした。一方、マウスには非感染性であった。次に、WT-THOVを非感染性マウスに感染し、その肝臓乳剤をマウスで継代接種することでTHOVのマウス馴化株（MA-THOV）を作製した。MA-THOVはマウスに致死的感染を引き起こした。この結果から、THOVが動物種を超えて感染する可能性を示すことができた。さらに、WT-およびMA-THOVのクローンを作製し、それらの遺伝子と病原性の違いを検討したところ、ウイルスの細胞への接着に作用するGP遺伝子に２箇所、ウイルスのゲノム複製に作用するPB2遺伝子に１箇所の違いを見出した。しかし、同定した変異を含む組み換えウイルスを用いた解析等 実際にこれらの相違がマウスの病原性に関与することを証明できていない。②京都市内で実験的に捕獲したハクビシンやアライグマなどの野生動物は、THOVに対する中和抗体を保有していることを明らかにした。一方、マダニの調査では、調査年や調査者により結果にブレが生じており、調査方法を含め、再検討が必要である。当該研究期間の大部分がコロナ禍にあり、計画通りに進めないことが多かった。研究の結論へ至る最後の実験や、関連学会・ジャーナルへの研究成果を報告も含め、最終的な研究の総括が遅れているため、現在の進捗状況を、区分（３）の「やや遅れている」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
マダニ由来の未知ウイルス動物に感染するかどうかの①実験的な証明においては、WT-とMA-THOVにおいて同定された相違（変異）が、マウスへの感染感受性への寄与と、そのメカニズムの解明をおこなう。本研究で同定した変異部位は、ウイルスが感受性細胞に接着するときに作用すると考えられるGP遺伝子（2箇所）と、ウイルスゲノムの転写・複製に関与するPB2遺伝子（1箇所）である。そこで、GPの機能解析を目的とし、WT-とMA-THOVの両ウイルスの細胞への接着効率を比較するとともに、ウイルスと細胞の融合効率について比較解析を行う。また、PB2の機能解析を目的として、細胞を用いた転写・複製アッセイを構築し、それを用いて両ウイルスPB2の転写・効率を比較解析する。最終的に、変異を導入した組み換えTHOVを作製し、マウスへの感染実験をおこない、マウスに病原性を示す原因部位を同定する。②自然界でのマダニや動物における感染状況を調査し実証するために、より精度の高い調査方法の確立を目指す。本研究で用いた、ハクビシンやアライグマ、野鼠の血清を用いたTHOV中和試験は感度・特異度も高く、その結果も信頼性が高いものと考えられた。一方、マダニのTHOV保有状況を調べるために用いたRT-PCRでは、設計したプライマーや調査者の技術等による結果の差異が大きく、改善する必要がある。これらの疫学解析は、本研究課題の期間において、新型コロナウイルス感染禍でサンプリングが困難であった。しかし、継続的な調査が必要であり、今後も続けていく予定である。また、得られた成果について、関連学会やジャーナルへ報告する。
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| Causes of Carryover |
今年度も、コロナウイルスに対する緊急事態の状況が続き、思ったように研究を推進できなかった。特に、出費のかかる細胞培養等の手法を用いたウイルス学的 解析や、高価な試薬・キット類を必要とする細胞生物学的・分子生物学的解析を十分に実施できなかったため、研究費を次年度へ繰り越すことにした。 本年度からの繰り越す研究費については、次年度に予定しているウイルス変異株の細胞生物学的・分子生物学的解析や、より精度の高い疫学調査方法の開発のために使用する。また、一部、研究成果を学会やジャーナルへ報告するための費用、研究のサポートのためのアルバイトの雇用に充てる。
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