2020 Fiscal Year Research-status Report
Gene expression analysis and subtype classification in the somatic cells of the mammalian ovary.
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19K06397
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
平松 竜司 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (70555284)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金井 克晃 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (30260326)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マウス / 卵巣 / 性分化 / トランスクリプトーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
卵巣の卵子形成に重要な役割を担う支持細胞（顆粒膜細胞）において、我々はこれまでに生後すぐの最初の卵胞形成や卵巣髄質領域の卵巣間質腺の形成に関与している特殊なFOXL2陽性顆粒膜細胞系譜存在があることを明らかにしており、その胎子卵巣支持細胞の性的不均一性の分子基盤と性的2型の破綻の分子機序を解明することを本研究の目的としている。昨年度まで行った胎子卵巣での一細胞トランスクリプトーム解析、ならびに体細胞系譜サブタイプのクラスタ解析・統計学的解析により得られた、FOXL2陽性顆粒膜細胞の不均一性に関与すると考えられる候補遺伝子について、ゲノム情報解析とin situ hybridizationによる各因子の発現と発現領域の同定を行った。その結果、胎齢12.5～13.5日生殖腺において発現が確認される遺伝子を同定し、その中でも雌雄生殖腺で発現に違いがみられた遺伝子に関して、定量的PCRによるmRNAの発現確認を行い、FOXL2陽性細胞の不均一性に関与すると考えられる有力な遺伝子を同定した。これら遺伝子について、CRISPR/Cas9法を用いた遺伝子の機能変異マウスの樹立の準備を進めている。また、精巣セルトリ細胞を特異的に除去する遺伝子改変マウス系と胎子生殖腺器官培養法を用いて、in vitroにおけるXY卵巣化誘導系を確立し、XY生殖腺の卵巣化における形態的変化を組織学的に詳細に解析するとともに、次世代シークエンサーを用いたRNA-seqにより、経時的な卵巣化遺伝子発現プロファイルデータを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度初頭は新型コロナウイルス感染症の感染拡大に伴い研究活動が大きく制限されたため、当初予定していた実験に遅れが生じたものの、宅で実施可能な遺伝子発現プロファイルの解析やデータベースによるゲノム情報解析を基にした候補遺伝子の探索を重点的に行うことで、FOXL2陽性細胞の不均一性に関与すると考えられる有力な遺伝子を同定し、遺伝子改変マウスでの機能解析の準備に進められている。また、in vitroでのXY卵巣化誘導系を確立したこと、その経時的な形態解析や遺伝子発現プロファイルデータの作成を行うなど、胎子卵巣支持細胞の性的不均一性の分子基盤と性的2型の破綻の分子機序の解明に向け前進したと考えられることから、おおむね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに同定したFOXL2陽性細胞の不均一性に関与すると考えられる有力な候補遺伝子について、CRISPR/Cas9法を用いた各遺伝子のframe-shift変異（コード蛋白の機能破壊）マウスの樹立を行い、そのマウス系統における性決定、生殖腺（卵巣および精巣）での表現型を調べる。それにより、FOXL2陽性細胞の不均一性への候補遺伝子の役割について解析を行う。また、in vitroでのXY卵巣化誘導系における遺伝子発現プロファイルについて、既知の正常な卵巣分化の過程で発現が上昇する遺伝子との共通項を同定するとともに、RT-qPCRおよびin situ hybridizationにより卵精巣化過程における時空間的な発現パターンの解析を行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症拡大に伴う研究活動の自粛とのより、2020年度に実施予定であった実験の一部が実施できなかったこと、在宅で実施可能な遺伝子発現プロファイルの解析やデータベースによるゲノム情報解析を基にしたFOXL2陽性細胞の不均一性に関与すると考えられる候補遺伝子の探索を重点的に行ったため。今後はさらなる発現パターン解析や遺伝子改変動物の樹立、in vitroでのXY卵巣化誘導系の実験に必要な試薬、実験動物代として使用を計画している。
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