2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K06447
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
加藤 博己 近畿大学, 先端技術総合研究所, 教授 (60330320)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒坂 哲 近畿大学, 先端技術総合研究所, 講師 (30625356)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 古生物 / げっ歯類 / 体細胞核移植 / ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、マウスの亜種間核移植胚の作製実験において、再構築胚が胚性致死を示す例が報告された（Ma H. et al. Cell Metab. 2016）。その原因は、細胞内でATPの合成に必要な呼吸鎖複合体の形成不全がおこったためと考えられている。呼吸鎖複合体を構成するタンパク質は、核およびミトコンドリアゲノムの両方に由来し、異種間核移植によって作製された再構築胚においては、呼吸鎖複合体を構成するタンパク質の不適合が起こる可能性を示唆している。そこで今年度は、本研究の実施にあたり必要となるレシピエント細胞質の研究を行った。体細胞核移植のレシピエント細胞質としてはブタ卵を用いた。食肉処理場で入手したブタ卵巣より未成熟ブタ卵を採集し、44時間体外成熟培養を行う間にマイトマイシンCを作用させた。マイトマイシンCは二本鎖DNAのグアニン同士を架橋することによって二本鎖DNAの開裂を妨げ、DNA複製を阻害し、また、遺伝子発現も阻害する。体外成熟培養の間に10μg/mLのマイトマイシンCで処理したブタ卵は、成熟培養後、単為発生処理を行っても2細胞期以降へ発生することは無かった。マイトマイシンCで処理したブタ卵と処理しなかったブタ卵を用いて核移植操作によって相互に核置換を行った所、マイトマイシンC未処理の卵細胞質と未処理の核の組み合わせでは18%の再構築胚が胚盤胞期へ発生したのに対し、マイトマイシンC処理した卵細胞質と未処理の核の組み合わせでは11%の再構築胚が4細胞期へ発生したがそれ以上のステージへの発生はなく、マイトマイシンC未処理の卵細胞質と処理したの核の組み合わせでは2細胞期へ発生した再構築胚はなかった。この結果より、マイトマイシンCでレシピエント細胞質となる卵を処理することによって、卵が本来持っているミトコンドリアの機能を低下させることができることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度は、共同研究を行っているサハ共和国科学アカデミーの都合により、シベリアにおける古代げっ歯類化石の探索ができなかった。そのため、保存状態の良い古代げっ歯類の体細胞は未だ得られていない。このため令和元年度は、異種間体細胞核移植を実装する際に必要なレシピエント細胞質に関わる研究を実施した。これは、保存状態の良好なげっ歯類の化石を発掘・入手しても、それらは、現在我々が実験に使用可能であるマウス・ラットまたはハムスターといった現生のげっ歯類とは亜種・種・属のレベルで異なる生物に由来するものと考えられるためである。細胞が生存するためにはエネルギー源となるATPの合成が不可欠であり、ATPは主にミトコンドリアにおいて合成されている。ATP合成に必要なのが呼吸鎖複合体と呼ばれるタンパク質複合体である。呼吸鎖複合体の構成要素は何種類ものタンパク質であり、それらの一部はミトコンドリアゲノムにコードされ、他は核ゲノムによってコードされている。そのため、異種間体細胞核移植において、核ドナーとなる体細胞核とレシピエント細胞質となる卵細胞質の種が異なると、呼吸鎖複合体を構成するタンパク質群の核ゲノムに由来するものとミトコンドリアゲノムに由来するものの間に不適合が生じ、結果として正常に機能する呼吸鎖複合体の形成ができず、ATP合成ができなくなることが異種間体細胞核移植で作製された再構築胚が低い発生能力を示す原因の一つであると考えられている。現在、多様な種に由来する培養細胞は入手可能であるが、その一方で、体細胞核移植の研究に用いることが可能な多くの卵が入手可能である動物種は少ないため、多くの種において同種間核移植の実施は困難である。異種間核移植において障害となる、核とミトコンドリアゲノムに由来する呼吸鎖複合体を構成するタンパク質群間の不適合を抑えるために必要な研究を本年度は実施し、成果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度中にシベリアを訪れ、研究用サンプルの入手を行う予定であるが、新型コロナウイルスの感染拡大によって、何時シベリアへ渡航できるのかは不明である。特に現在の状況を鑑みれば、ロシアにおいては感染の拡大が日本よりも遅いため、8月までに渡航可能になる可能性は低く、9月以降になると考えられる。そのため、研究用古代げっ歯類化石の入手までの間、令和元年度に実施していたレシピエント細胞質に関わる研究を更に進める。具体的には、体外成熟培養中にマイトマイシンC処理を行ったブタ卵へ、体外成熟培養中にマイトマイシンC処理を行わなかったブタ卵に由来する細胞核と、同様に体外成熟培養中にマイトマイシンC処理を行わなかったブタ卵に由来するミトコンドリアを含むサイトプラストを融合させて作製した再構築胚の発生能力とATP生産能力を検討する。また、体細胞由来のミトコンドリアと卵由来のミトコンドリアはその性質が異なる可能性があるので、ブタ培養細胞由来のミトコンドリアを回収し、サイトプラスト化して同様に融合させ、胚の発生能力とATP生産能力を検討する。また、同様の実験をマウスおよびラットの卵を用いて実施し、げっ歯類の体細胞核移植におけるレシピエント細胞質の調整方法の検討を行う。さらに、現生のげっ歯類であるアカネズミやクマネズミの培養細胞を核ドナーとし、マウスやラットの卵をレシピエント細胞質とした異種げっ歯類間の体細胞核移植実験を行い、作製された再構築胚における移植核のリプログラミングの経過の検討を行うと共に、再構築胚におけるATP生産能力の解析を行う。
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| Causes of Carryover |
令和元年度は予定されていたシベリアへの渡航ができなかったため、予算として計上していた旅費を物品費として使用したが、78,030円残った。令和2年度にはこの78,030円を加えた1,178,030円を研究の遂行に使用する。
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