2020 Fiscal Year Research-status Report
臓器特異的遺伝子編集によるRasドライバー発癌制御遺伝子座解析系の実証的構築
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19K06456
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
鈴木 昇 三重大学, 地域イノベーション推進機構, 准教授 (00202135)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 肺癌モデル動物 / Ras / QTL解析 / 遺伝子編集 / CAS9 / 臓器特異的 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低分子量GTPaseの一種であるRASは、細胞増殖などの細胞内シグナル伝達を制御する分子スイッチであり、GDP結合型からGTP結合型への変換によって活性化される。RASを恒常的に活性化させる特定の遺伝子変異はヒトの全癌の30％で検出され、主要ながんの原因となることが知られている。ヒト肺癌においては、10-20％はRas遺伝子の活性化変異に起因するとされる。 私は、令和元年度より、独自に樹立した実験動物のマウスの２つの系統（Ras遺伝子変異に抵抗性のA/J系統と高感受性のC57BL/6系統）を用いて、量的遺伝子座（QTL）解析を進め、新規の制御遺伝子座を見出してきた。令和元年度までに、肺発癌を制御する１５の遺伝子座を新たに見出し、責任遺伝子として７２遺伝子を候補した。
実験動物の使用数を減少させるために開発したRNA干渉in vitro系（令和元年度樹立）を用いて、令和１－2年度で総計11種類の新規遺伝子が、RNA干渉によって肺癌細胞の増殖を抑制することを見出した。
In vivo検証用の実験動物、C57BL/6-Ryr2tm1Nobs ；CAS9マウスの交配は順調に進み、各遺伝子座についてホモ（ダブルホモ）個体が得られつつある。
肺特異的に、これらの11種類の遺伝子を破壊するための、遺伝子特異的ｇＲＮＡとＣｒｅ遺伝子を発現可能なレンチウイルスベクター（pl-gRNA-Cre）の作成とウィルス精製も順調に進行中である。最終的に、ウィルスは、使用動物を減らすために3種類の遺伝子を同時に破壊できるようデザインしたウィルスが4種類、1種類の遺伝子を破壊できるようにデザインしたウィルスを11種類を作製されることになる。次年度、十分なダブルホモ個体が増え次第、機能的なin vivo実験が可能となる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度は、前年度実験動物の使用数を減少させるために開発したRNA干渉in vitro系令和2年度は、さらに前年度実験動物の使用数を減少させるために開発したRNA干渉in vitro系（令和元年度樹立）を用いて新規遺伝子をもとめ、2年度中で、総計11種類の新規遺伝子がRNA干渉によって肺癌細胞の増殖を抑制することを見出すことができた。
In vivo検証用の実験動物、C57BL/6-Ryr2tm1Nobs ；CAS9マウスの交配は順調に進み、次年度内には各遺伝子座についてホモ（ダブルホモ）個体が十分な数量得られる土台を築いた。
11種類の遺伝子をin vivoで機能検証するため、肺特異的に遺伝子破壊するためのレンチウイルスベクター（pl-gRNA-Cre）の作成とウィルス精製も順調に進行した。使用動物を減らすために3種類の遺伝子を同時に破壊できるようデザインしたウィルスベクターを4種類、1種類の遺伝子を破壊できるようにデザインしたウィルスベクターを11種類、すべてのコンストラクションを順調に作製した。ウィルス精製も順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vivo検証用の実験動物として、C57BL/6-Ryr2tm1Nobs ；CAS9マウスを使用した実験結果を補うため、AJ-Ryr2tm1Nobs ；CAS9マウスも樹立する。動物個体を使うin vivoの前実験として、使用個体数を減らすため、ウィルスベクターDNAまたは精製ウィルスを用いての、in vitro肺癌細胞増殖抑制実験を行う。より候補遺伝子を絞ってin vivo実験に臨む。
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