2019 Fiscal Year Research-status Report
世代を通した導入遺伝子の発現安定化を目指したDNAメチル化の人為的制御法の確立
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19K06460
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
山本 耕裕 大阪医科大学, 医学部, 講師 (20613558)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | メチル化 / transgenerational |
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| Outline of Annual Research Achievements |
導入遺伝子のサイレンシングはプロモーターの高メチル化に起因すると考えられている。ほ乳類ではDNAメチル化パターンは発生初期と配偶子形成過程に大きく変動することが明らかになっているが、魚類の配偶子形成におけるDNAメチル化パターンは未だわかっていない。そのため、メダカ配偶子形成におけるDNAメチル化パターンの変動を免疫組織的手法と次世代シークエンサーを利用した網羅的解析から行った。5メチルシトシン抗体を用いた免疫染色より、メダカ配偶子形成におけるメチル化状態をイメージングにより定量した結果、ほ乳類の配偶子形成に比べ、明瞭な変動が認められないことが明らかになった。また、FACSを用いて各発生段階の生殖細胞を採取し、網羅的なメチル化状態を解析した結果においても、免疫染色と同様に大きな変動が確認されなかったことから、魚類においては配偶子形成におけるDNAメチル化の変動は少ないことが明らかになった。
胚発生ならびに配偶子形成におけるDNAメチル化の役割を解析するため、DNAメチル化修飾酵素のノックアウトメダカを作出した。メダカにおいて新規メチル化修飾酵素はDnmt3a, Dnmt3b1,Dnmt3b2の3つが同定されており、Dnmt3全てのノックアウトメダカを作成した。それぞれのシングルノックアウト個体では表現系は得られなかったため、現在ダブルノックアウトおよびトリプルノックアウトの作出を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
つい最近、メダカ配偶子形成におけるDNAメチル化状態を解析した論文が発表された。これらの論文では当研究結果とは異なり、DNAメチル化状態は分化時期により大きく変動することを示している。この結果を再検討するため、本研究のデータの見直し、および再実験を検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
胚発生ならびに配偶子形成におけるDNAメチル化の役割を解析するため、新規メチル化修飾酵素のダブルノックアウトおよびトリプルノックアウトの作出を行う。トリプルノックアウト個体は新規メチル化を導入することが出来ないと考えられるため、トリプルノックアウト個体を解析することにより、魚類でのDNAメチル化の役割が明らかになると期待される。
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| Causes of Carryover |
今年度は所属する研究室に既存の研究機器および消耗品を使用することができたため、次年度使用額が生じた。
次年度は次世代シークエンサーの使用を考えているため、今年度の予算を次年度に使用する予定である。
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