世代を通した導入遺伝子の発現安定化を目指したDNAメチル化の人為的制御法の確立

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06460
• Research Institution: Osaka Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 山本 耕裕 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (20613558)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 遺伝子サイレンシング / DNAメチル化 / Dnmt

Outline of Annual Research Achievements

本研究では世代を越えると導入遺伝子の発現が抑制される“導入遺伝子サイレンシング”を回避する方法の確立を目指す。これら遺伝子サイレンシングの実体は導入遺伝子プロモーターの高DNAメチル化に起因すると考えられているため、導入遺伝子のサイレンシグにおけるDNAメチル化の関係を明らかにすることを目的とする。哺乳類では初期発生と生殖細胞形成過程において大規模なDNAメチル化の変動が認められるため、メダカ雌雄配偶子形成過程と初期発生におけるDNAメチル化パターンの変動をDNAメチル化の特異的である5メチルシトシン抗体を用いた免疫組織的手法と次世代シークエンサーによるDNAメチル化状態の網羅的解析から解析した。これらの解析からメダカにおいては哺乳類でみられるような大規模なDNAメチル化の変動は起こらないことが明らかになった。しかしながら、卵形成過程においてDNAメチルの減少が認められるため、母方より導入遺伝子が次世代に伝わる際に遺伝子サイレンシングが起こると示唆できる結果を得た。
導入遺伝子のサイレンシングにおけるDNAメチル化の関わりを直接的に明らかにするため、De novo DNAメチル化の修飾酵素であるDnmt3のノックアウトメダカの作出をCrispr-cas9を用いて行った。作出したダブルノックアウトメダカは成魚まで生存可能であるため、次年度はこれらノックアウトメダカを用いて導入遺伝子のサイレンシグパターンを解析する。これらの解析により、導入遺伝子のサイレンシングにおけるDNAメチル化の関わりを明らかにする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

全ゲノム解析からメダカでは両性の幹細胞型生殖細胞および分化型生殖細胞、精子では高メチル化状態であることが明らかになった。しかしながら、成熟卵においてはメチル化程度が減少することが分かった。さらに5メチルシトシンの染色から幹細胞型、第一減数分裂、第二減数分裂それぞれの生殖細胞においてDNAメチル化パターンには変動が少ないこと、初期胚発生においてもDNAメチル化パターンには変動が少ないことが明らかになった。そのため、導入遺伝子が母方から次世代に受け継がれる際に遺伝子サイレンシングが起きる可能性が示された。
メダカゲノムには３種類のDnmt3が存在するため、Crispr-cas9を用いてdnmt3b-1,2のダブルノックアウトメダカを作出した。ダブルノックアウトメダカは成魚まで生存可能であるが、成魚における色素に明瞭な違いがみられた。

Strategy for Future Research Activity

DNAメチル化の網羅的解析からメダカ生殖細胞形成過程ではほ乳類に比べDNAメチル化の大規模な変動はみられないが、成熟卵においてDNAメチル化程度が減少することが明らかになった。これまでの報告とメチル化シトシンの免疫染色の結果から初期発生でもDNAメチル化の初期化が起こらないことを考慮すると、卵形成において導入遺伝子のサイレンシングが起こると示唆される。この可能性を検証するため、作出したDnmt3bダブルノックアウトメダカにおいて導入遺伝子のサイレンシングパターンを解析する。これらの解析により、導入遺伝子のサイレンシングにおけるDNAメチル化の関わりを明らかにする。

Causes of Carryover

導入遺伝子のサイレンシグを解析するために実体蛍光顕微鏡を導入したため、使用額の差異が生じた。
次年度はdnmt3ノックアウトメダカでの遺伝子サイレンシングを解析するため、DNAメチル化状態を解析することが出来る、バイサルファイトシークエンスやメチル化シトシン抗体の購入に研究費を使用する予定である。