2019 Fiscal Year Research-status Report
Do sperm preselect the sex of Japanese spiny rats (Genus Tokudaia) which lost their Y chromosome?
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19K06470
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
越本 知大 宮崎大学, フロンティア科学総合研究センター, 教授 (70295210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三谷 匡 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (10322265)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 性染色体 / トネゲズミ属 / 減数分裂 / X-精子/O-精子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類のY-染色体は進化の過程で矮小化し、消失する途上にあるとする仮説がJS Gravesらによって提唱されている。実際、地球上にはY-染色体を持たないXO-型哺乳類が3種存在し、うち2種は、日本固有種であり環境省から絶滅危惧種に指定されている「トゲネズミ（Tokudaia属）」属の齧歯類、アマミトゲネズミ（T. oshimensis）とトクノシマトゲネズミ（T. tokunoshimensis）である。これら稀少な日本の哺乳類は、雌雄ともにY-染色体を欠くXO-型の性染色体型を示し、哺乳類の性決定機構進化の先端にいるとも考えられているユニークな研究資源である。トゲネズミの精巣では染色体数が異なるX-精子とO-精子が存在しているのだろうか？またどのような仕組みでXO-型を崩さず種を維持しているのだろうか？これら根源的な疑問は1970年代から問い続けられてきた。しかし絶滅が危惧される希少種を研究対象とすることは極めて困難で、これまでに科学的なアプローチは殆どなされてこなかった。
一方で我々は、環境省などの許可を得て希少野生種の保全を目的としたアマミトゲネズミの棲息調査と飼育交配試験を継続するなど、希少種トゲネズミの保全生物学的な取組みを継続してきた。その結果、偶発的に死亡した本種から精子を採取し、その一部を研究に活用することが可能となった。そこで進化の果てにY-染色体を欠損し、性染色体進化の先端に到達したとされるトゲネズミ属の雌雄分化機構に関する根源的疑問に答えるため本研究を立案した。研究資源としてY-染色体を欠く日本固有の哺乳類を用い、XO-型の生殖幹細胞の減数分裂によって生じる生殖細胞の性染色体構成と機能を明らかにすることで、哺乳類の「性」が向かう方向を提示することが本研究のゴールである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
精子を対象とした性染色体選別試験を試料の入手が極めて困難で限定的なトゲネズミ（Tokudaia属）で直接実施する前に、モデル生物を用いて至適条件を十分に検討し、設定たうえで実施せねばならない。そのため、稀少試料を用いる前段階として、マウスをモデルとしたX-/Y精子の線別条件設定のための試験から開始した。性染色体判別法として当初想定したマイクロダイセクション法は、細胞ごとに単離して切り出し、条件設定が厳格なシングルセル+マルチプレックスPCRにより個別判別するため、手技の確立が煩雑である事から第1選択肢とせず、より多量の試料を単回で即座に判別できるフローサイトメトリー法を検討することとしBechton,Dechinso社のFACSCaliberを用いた条件設定を行った。
マウス精子の染色は当初、標準的な二本鎖DNA染色法であるHoechst33342法を検討したが、前処理・染色条件に再現性が得られず、試行の結果、C548 Cell Cycle Assay Solution Deep Red(同人化学)を用いる事で改善した。そこでC548で染色したマウス精子頭部を対象に、FSC/SSC分布から精子集団のゲーティングを試みた。試行の結果、低分離度ではあるがマウス精子のX-型とY-型のDNA量の差を反映した二峰性曲線が検出できた一方でSSC分布のバラつきが問題となった。この点は試料を前固定する事で解決できる事もわかった。しかし前固定試料を用いると、二峰性の分離度が不明瞭となるため、FSC/SSC分布の条件の再設定が必要となった。丁度この時期にコロナ感染が問題となり、その対応に時間を割かれ、また年度末のマシンタイムの確保も困難となり実験が遅延し、二峰性の判別が低解像度で再現できた時点で年度を終了し、明瞭な分離条件の抽出にまでは到らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
遅延している初年度研究を進めて、マウス精子での解像度の高い分離条件の設定を急ぐ。トゲネズミはX-/O-型でありX-/Y-型のマウス以上に両型の精子のDNA量に差があると考えられる事から、本試験ではより明瞭な分離が可能となると予測できる。従って本研究の最大の疑問を解決し、結果を明確に提示できると考える。FACSCaliberを用いた分離を選択する更なる利点として、研究の次段階として以下に示す、セルソーティングによる精子選別に直接移行できる事もあげられる。
トゲネズミ精子にX-/O-精子の両者が共存する根拠となるDNA含有量の二峰性が確認できれば、トゲネズミ胚は理論上、XX、XO、OOいずれの核型になりうるが、実際にはXO型の個体しか確認されていないことから、受精または発生のいずれかの過程でXX-型とOO-型の胚は選抜され発生が停止し、XO-型の個体のみが生まれるとする作業仮説が成立する。そこでX-及びO-精子をセルソーティングして選別し、それぞれの精子をマウス卵に顕微受精させたハイブリッド胚を作成し、発生を検証するため、予備試験として研究分担者と共同して、トゲネズミ属齧歯類に最も近縁のアカネズミ（Apodemus）属精子をマウス卵に顕微授精させる、Apodemus-Musハイブリッド胚の作成実験および、除核したマウス胚細胞質にアカネズミ精子頭部2個を顕微授精させる雄性2倍体胚の作出試験を開始し、精子由来のXX-、XO-、OO-型胚の発生能を直接検定するための手法的な布石を打つ。
一方で、予想に反してFACSCaliberにより二峰性が認められず、精子成熟時点でX-ないしはO-のいずれかの精子が選択的に作出されない可能性が示された場合、いずれの精子が選択的に淘汰されるのかを明確化する必要があるため、同時にマイクロダイセクション法についても適用についても適用を検討する。
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| Causes of Carryover |
研究の第一段階である、X-/O-精子の選別のための条件選定試験が遅延し、また種々検討の結果、当初第1選択肢候補としていた手法を別法に変更したことで消耗品等の準備に必要な経費が予算額を下回った。加えて年度末に予定していた学会参加や班会議がコロナウイルスによる非常事態宣言で中止/延期となったこ事から旅費の使用がなくなった。前者については次年度に集中的に実験することで、後者については積極的な情報交換や情報発信を行うために、それぞれ必要な経費と考え次年度にくり越すこととする。
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Research Products
(1 results)
