2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K06472
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
塩澤 誠司 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任准教授 (10447039)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゲノム編集におけるノックイン効率の上昇を目的とし、相同組み換え効率の増幅因子の有効性について検討を行っている。
本年度は、これまでにその効果が示唆される５つの因子(遺伝子A,B,C,D,E)について、マウスES細胞におけるノックイン効率に与える影響について予備検討を行った。この目的のため、マウスES細胞のSox2遺伝子座の3'端に対し蛍光レポーター遺伝子であるVenusをノックインし、融合タンパクとして発現させるようターゲティングベクターを設計、構築した。このベクターと共にSox2遺伝子3'端に対するgRNA及びCas9の発現ベクター、ノックイン効率増幅因子候補の発現ベクターをマウスES細胞に導入した。この結果得られる正しい相同組み換え体では、VenusがSox2遺伝子の核移行シグナルをトラップすることにより、核に局在して発現する。ハイコンテンツイメージアナライザーによる画像解析により、Venusが核に局在して発現するコロニーの割合を定量した。
その結果、遺伝子A,B,C,Dの４因子を同時に導入した際に最もノックイン効率が高かった。一方で、遺伝子Eを加えた場合には効率上昇が認められなかったことから、遺伝子Eはこの系において負の影響を有することが示唆された。一方、遺伝子A,B,C,Dをそれぞれ単独で導入することによって、どの因子においても有意なノックイン効率の上昇効果が認められた。
次に、マウス受精卵におけるノックイン効率上昇効果の検討を進めている。この目的のため、まず、上記の実験から最もノックイン効率上昇効果が高かった遺伝子Aについて、リコンビナントタンパクを作成した。現在導入条件の検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は当初の予定通り、マウスES細胞への遺伝子導入条件やセレクション条件、またハイコンテンツイメージアナライザを用いた画像解析プロトコルの確立を行い、予備実験の実施に至っている。これまでの結果から、それぞれのノックイン効率増幅因子の効果が明らかになり、これらはヒトiPS細胞で認められた結果と矛盾しないものであった。
マウス受精卵におけるノックイン効率の検討においては、ノックイン効率増幅因子のリコンビナントタンパクを作成し、予備検討を開始した。この結果から、導入条件の調整が必要であることが明らかになり、現在最適化を進めているものの、概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は今年度に確立した実験系を用い、引き続きマウスES細胞におけるノックイン効率増幅因子の効果の検証を行う。これまでに検討した因子についてさらに検討を進めると共に、他の候補についても検討を開始する。具体的には、マーモセットES細胞及びヒトiPS細胞を用いたトランスクリプトームデータから、マーモセットES細胞において高発現する遺伝子のうち、相同組み換えにおいて機能を有する遺伝子を絞り込む。
また、マウス受精卵におけるノックイン効率の検討を実施する。今年度の予備検討から、添加するタンパクの濃度によっては細胞死が認められ、導入条件の再検討が必要であることが明らかになった。そのため、導入時のタンパク濃度の低下や精製法などの条件検討を行う。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額は発生したものの、予定の６％以下であり、ほぼ想定通りといえる。使用計画の変更は生じない。
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Research Products
(8 results)
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[Presentation] IN VITRO DISEASE MODELING OF THE FTDP-17 TAU R406W MUTATION USING PATIENT-DERIVED IPSCS2019
Author(s)
Mari Nakamura, Seiji Shiozawa, Daisuke Tsuboi, Mutsuki Amano, Hirotaka Watanabe, Sumihiro Maeda, Taeko Kimura, Sho Yoshimatsu, Fumihiko Kisa, Celeste Karch, Tomohiro Miyasaka, Akihiko Takashima, Naruhiko Sahara, Shinichi Hisanaga, Takeshi Ikeuchi, Kozo Kaibuchi, Hideyuki Okano
Organizer
International Society for Stem Cell Research 17th annual meeting
Int'l Joint Research
