2020 Fiscal Year Research-status Report
減数分裂前期に適量のDNA二重鎖切断がつくられるメカニズムの解明
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19K06486
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
佐藤 綾 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(RPD) (40595112)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 減数分裂 / DNA二重鎖切断 / 染色体 / 線虫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
一般に、DNA二重鎖切断は、染色体の不安定化を招くため、細胞にとって非常に危険な存在である。しかしながら、減数分裂前期、相同染色体間の交叉を形成するため、生殖細胞は、計画的に、一定量のDNA二重鎖切断を作らねばならない。これは、トポイソメラーゼ様酵素SPO-11を発現させ、その活性を制御することで実現されるが、この制御機構には未解明の点が多い。特に、 DNA切断量が多すぎる場合は、修復しきれないゲノムの傷が残ってしまうため、SPO-11活性を抑制するフィードバック機構が存在するのではないかと予測されるが、その分子メカニズムは謎である。我々は、これまで線虫Rec114ホモログのリン酸化がDNA二重鎖切断量を調節することを明らかにした。また、Rec114ホモログが、Intrinsically disordered regionを持つことから、Rec114ホモログの核内局在を生細胞において可視化解析した。GFPタグを付加したRec114ホモログは、核内の核膜付近にdroplet状の局在をすることが観察されたため、これをさらに解析したが、最終的に、このdroplet状の局在は、GFPを付加したことによる人為的なアーティファクトであるらしいという結果が得られた。我々の行ったGFP付加は、表現型解析の結果、Rec114ホモログの減数分裂への機能を損なう効果はなかったが、Rec114ホモログの局在を一部人為的に変えていることが考えられた。加えて、Rec114ホモログタンパク質の量が、高齢の線虫個体では、若齢と比べて減少していることも見つけた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
一時期、新型コロナウイルスによる研究室の閉鎖、子供の学校の閉鎖や、テレワークが増加したことにより、実験に遅延が生じている。また、GFPタグを付加したRec114ホモログの局在が、一部、GFP付加のアーティファクトであることは予想外の展開であった。当初、GFPを付加しても、特に表現型に支障は見られなかったため、生細胞観察を進めていた。しかしながら最終的に、野生株におけるポリクローナル抗体を用いた免疫染色では、GFP付加した株を用いた生細胞観察や免疫染色で見られるdroplet状の局在が見られないという違いがあることが判明し、固定条件や生細胞観察の条件を検討した結果、GFPを付加したことが droplet状の局在の原因になっていると結論づけられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、リン酸化型Rec114ホモログに対する特異的抗体を作製し、その局在や量を免疫染色や生化学的手法より解析する。また、これまでの我々の予備的実験結果より、Rec114ホモログは、母体の加齢に伴ってタンパク質量が低下することがわかっている。Rec114ホモログのリン酸化量が加齢によって増減するのかどうかも解析する。特異的抗体の作製を平行して、リン酸化量の定量化は、phos-tagゲルを用いたウエスタンブロットを用いた手法でも検討する。同様の解析をPP4フォルファターゼ欠損株でも行い、Rec114ホモログのリン酸化量が増えているかどうかを検討する。また、生化学的手法より、Rec114ホモログの相互作用因子を同定することを目指し、最終的に、Rec114ホモログがSPO-11活性を制御する分子基盤を理解することを目指す。
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