2020 Fiscal Year Research-status Report
真核生物リボソームの品質管理における基質認識機構の解明
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19K06487
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
北畠 真 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (10321754)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | リボソーム / 品質管理 / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度に「機能不全リボソーム」および「それをユビキチン化するE3リガーゼ複合体」の双方に結合する因子の同定が行われた。また、無細胞系で合成したE3リガーゼ構成要素の部分断片との結合アッセイにより、この因子がE3リガーゼのさまざまな因子に相互作用を行うことまでを示すことができた。今年度はこの結果を受けて、この因子とリボソームの結合についての詳細な解析を行った。
この因子にFlagタグとHis6タグを導入しても、機能不全リボソームの分解に与える影響は軽微だったことを確認した上で、この二重タグ付きの因子を利用してCRAC解析（生細胞を紫外線でクロスリンクし、変性条件下で目的タンパク質を精製、結合してきたRNAを部分分解した上でRNA-seqを行い、ねらいのタンパク質が結合するRNA配列を同定する手法）を行った。得られた結果を酵母のゲノム上にマップしていったところ、きれいにrDNAの上にピークが並ぶことが明らかになった。これらのピーク配列を酵母リボソームの三次元構造の上にプロットし、リボソーム上の特定の位置にこの因子が結合することが明らかになった。
現在のところ、この因子とリボソームを混ぜ合わせ、E3複合体を投入してもin vitroでのユビキチン化は再現されていない。なお他の因子が必要なものと考えられる。E3複合体との結合を指標に探してくる方法では限界があると考えられるため、今後はin vitroのユビキチン化アッセイに酵母のライセートを投入して活性の回復を調べたり、回復する場合にはそのライセートから生化学的に活性成分を精製してくることに挑戦したい。そのための予備実験として、酵母でえE3複合体を過剰発現させる条件を検討し、これまでに得られていたより数倍の収率が得られる条件を決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
重要な因子についてE3複合体とリボソーム双方への結合領域がどこであるかが明らかになってきている。今後の方針として生化学的な精製を試みる必要がある、との結論が明確になってきたが、そちらについてもE3複合体の発現条件の改善など具体的な成果が得られてきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はE3複合体をこれまで以上に大量に精製した上で、in vitroユビキチン化の系を指標に、目的活性（機能不全リボソームのユビキチン化に必須の因子の完全解明）を示すタンパク質を網羅的に解明していきたい。そのためにまず酵母においてE3複合体の発現条件を詰めたが、この作業にはさらに多くのE3複合体の調製が必要になることが考えられる。そこで３年目には昆虫細胞Sf9の系を用いてE3複合体を用意することにも挑戦したい。類似の複合体がSf9で調製された報告があり、酵母を用いるよりも効率的に複合体が得られる可能性がある。ただし過去の報告からは複合体の１つの因子Rtt101/Cul8が細胞内で分解されやすいとの指摘もあった。Rtt101の抗体を調製して、この因子の健全性を確認しながら、発現条件の詳細を注意深く詰めていく必要があるだろう。
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| Causes of Carryover |
当該年度においては、所属している研究室の教授が任期途中での早期退職をする、というイレギュラーなイベントがあり、そのための研究室の整理や物品の移動等が発生して当初の予定どおりの研究の進行がかなわなかった面があった。また、放射性同位元素を用いた実験がこの研究計画には多く含まれているが、これまで使用していたRI施設が年度の途中で閉鎖となり、新たに大学の本部にあるRI施設へ再登録をして実験のセッティングをゼロからやり直す必要があった。これらの理由により当初の予定から研究の進行および経費の執行の両方が遅れている。
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