2020 Fiscal Year Research-status Report
核酸導入に関わる選択的オートファジー複合体の制御機構の解明
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19K06488
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
土屋 惠 大阪大学, 生命機能研究科, 特任助教(常勤) (00390691)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 遺伝子導入 / オートファジーレセプター / 複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞の外来核酸からの防御機構として、オートファジーによる分解に重要な役割を持つオートファジーレセプターp62に着目し、この分子機構を制御し遺伝子導入の効率を上昇させるために、核酸導入により形成されるp62複合体の機能解明を行う。核酸導入直後におこるエンドサイトーシスによりp62のリン酸化が急激に誘導されることから、本年度はp62のリン酸化kinase であるTBK1の機能に着目した。エンドサイトーシス直後より強く誘導されるp62 S403のリン酸化にはCK2およびTBK1の２つのkinaseが関与しているが、遺伝子導入前にそれぞれのinhibitorの添加を行なったところ、特にTBK1の抑制によりS403のリン酸化が抑えられた。このことからTBK1およびその関連因子がp62複合体の重要なコンポーネントであると予想されたため、それらの因子を同定するためにTBK1ノックアウトMEF細胞の樹立を行った。野生型MEF細胞に含まれるTBK1をゲノム編成にてノックアウトを行い、そこから複数個のsingle clone細胞株を得た。得られた細胞株のTBK1タンパクの残存の程度をwestern blotにて確認し、100%に近くTBK1がノックアウトされている細胞株を抽出した。この細胞を用いて遺伝子導入効率を確認したところ、野生型MEF細胞に比べ明らかな遺伝子導入効率の上昇が認められたことから、TBK1がp62を介した遺伝子導入の制御に強く関わっていることが明らかとなった。さらにTBK1 inhibitorが有力な遺伝子導入補助薬として使用できる可能性が予想されたことから、すでに市販されているinhibitorに類似構造を持つ化合物を約80種類選択し、これまでの化合物スクリーニングと同様の方法で、細胞添加剤としてより効果が高いものを指標に化合物のスクリーニングを行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は特に前半期は他研究機関との共同研究や大量細胞培養の継続が難しい状況であったため、これまでの予備実験で得られていた、p62複合体因子として予測されるタンパク質の機能解析を中心とした実験を行なった。特にリン酸化kinaseであるTBK1の抑制により明らかな遺伝子導入促進効果が得られることがわかったため、TBK1およびその関連因子のp62に及ぼす機能と遺伝子導入との関わりを詳細に検討することとした。ゲノム編集にてTBK1ノックアウトMEF細胞の樹立を行いTBK1の機能を明らかにするとともに、既知のTBK1 inhibitorおよび化学構造が類似する低分子化合物の中から遺伝子導入促進作用を持つ化合物についてのスクリーニングを行うなど、現在の環境で実行可能な実験を着実に進めることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度樹立したTBK1ノックアウトMEF細胞へ、再度TBK1を発現させたTBK1レスキュー細胞を樹立し、TBK1を戻したことで遺伝子導入効率が変化するかどうか、すなわちTBK１の遺伝子導入への関与を確認する。また、kinase活性を持たないTBK1 K38A mutantを発現させた変異型TBK１レスキュー細胞株も同時に樹立し、TBK１のkinase活性の遺伝子導入効率への重要性を確認する。これらによりエンドサイトーシス直後にTBK１が活性化されp62複合体形成をするまでに関わると予想される因子群のカスケードが明確になり、TBK1 inhibitorの作用点を明確化できる。またそれぞれのリコンビナントタンパクを生成し、in vitro実験にて相互作用を明らかにする。さらに上記二つのレスキュー細胞株に核酸を導入した直後のTBK1およびp62に結合するタンパク質を精製し、新規複合体因子を同定する。TBK１の活性の有無による構成因子の変化から、得られた因子の分子機能を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
本年度は複合体の精製と構成因子の同定をより的確な条件で行うために、エンドサイトーシス直後に起こるp62の翻訳後修飾などの変化から予想された因子の機能解析を中心に行なった。細胞の樹立などで時間がかかったことから、複合体精製や受託研究のための経費は次年度へ繰り越されたが、これまでの実験により、複合体形成のタイミングや予想される複合体構成因子群が明らかになりつつある。次年度はこれらの結果をベースにして、効率よく新規複合体因子の同定を進める予定である。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] THOC4 regulates energy homeostasis by stabilizing TFEB mRNA during prolonged starvation2021
Author(s)
Fujita T, Kubo S, Shioda T, Tokumura A, Minami S, Tsuchiya M, Ogawa H, Hamasaki M, Yu L, Isaka Y, Yoshimori T, and Nakamura S
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Journal Title
Journal of Cell Science
Volume: 134
Pages: 248203-248203
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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