分化制御を担う転写プロセスにおけるヒストン脱メチル化酵素の役割

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06492
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 秋山 智彦 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (20570691)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ヒストン脱メチル化酵素 / ヒト多能性幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、同じ基質を触媒する2つのヒストン脱メチル化酵素JMJD3とUTXが相互作用によって遺伝子発現が調節されるかどうかを検証する。今年度はChIP-seq法によりJMJD3とUTXのゲノムワイドな局在解析を行い、ES細胞と分化細胞では局在パターンが異なることを明らかにした。未分化なES細胞では、JMJD3の局在は検出されず、UTXのみが活性化遺伝子の制御領域に局在することがわかった。一方で分化細胞では、JMJD3は分化に関連する遺伝子領域に局在し、UTXはそれを制御する領域に局在していることがわかった。
またJMJD3遺伝子とUTX遺伝子について、CRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集を行い、それぞれをノックアウトした欠損ES細胞株を樹立した。遺伝子の5’側コーディング領域にguide RNAを設計することにより、開始コドン直下に終止コドンを人工的に挿入させ、翻訳を阻害しタンパク合成が起こらないようにした。UTXノックアウト株については、UTX発現の残存が確認されたため、新たなguide RNAの設計を行い、完全にノックアウトした細胞株の樹立を行った。
またJMJD3とUTXに結合する蛋白質の種類を比較し、特異的に会合する因子を同定するため、ES細胞および分化細胞から蛋白質を抽出し、特異的抗体を用いてJMJD3およびUTX複合体を精製した。各複合体の構成蛋白質を質量分析法により解析した結果、それぞれに特異的に会合する因子を同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度の計画予定であるノックアウト細胞株の樹立に成功したため

Strategy for Future Research Activity

JMJD3およびUTXを欠損させたES細胞およびその分化細胞を用いて遺伝子発現プロファイリングを行う。分化誘導にはActivin A, BMP4, VEGFを使った中胚葉系を予定しており、ES細胞を均一に分化できることが分かっている。遺伝子発現はRNAシーケンス法により網羅的に行う。ES細胞と欠損ES細胞を比較することによりJMJD3およびUTXが制御する遺伝子群を同定する。またノックアウト細胞を用いて、遺伝子のエンハンサー領域にリクルートされる転写因子の結合の有無やRNAポリメラーゼの堆積および伸張反応を調べることにより、転写制御プロセスにおけるJMJD3とUTXの役割を明らかにする。またエンハンサー領域やGene body領域におけるヒストン修飾の変化を調べることにより、JMJD3とUTXが制御するクロマチン構造変化を明らかにする。

Causes of Carryover

今年度中に発注予定であった試薬の納期が遅れることがわかり、次年度に繰り越し発注することにする。