Regulatory mechanism of pH- and nucleic acid-dependent K63Ub chain elongation

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06496
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 黒川 裕美子 国立遺伝学研究所, 新分野創造センター, 特任研究員 (10381633)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ユビキチン / DNA / RNA / K63 / pH / E2

Outline of Annual Research Achievements

2019年度は、in vitroおよびin vivoの解析に向けた材料調製や条件検討を集中して行った。

「pHに依存した核酸促進型K63Ub鎖形成促進反応の分子メカニズム解明」(in vitro)：
pH依存的なUbc13 /Mms2の構造変化の解析については、Thermal Shiftアッセイ系を構築し、実際にこの手法でタンパク質構造変化が解析できることを確認した。さらに核酸存在下での変化についても解析可能なことがわかった。また、Ubc13/Mms2における核酸相互作用残基の同定については、分裂酵母Ubc13/Mms2の構造を予測し、塩基性残基の位置をもとに核酸結合モデルを作成した。さらに種間での保存性マップも作成し、比較することで核酸結合可能領域の絞り込みを行った。Ub鎖伸長のリアルタイム観察については、高速AFMでの解析条件の検討を行い、核酸・タンパク質複合体を高い分解能で観察できるbufferや試料調製方法を確定することができた。さらに数種のクロスリンクによる観察方法も取り入れることで多面的な解析が可能になった。
「細胞内pH環境による核酸促進型K63Ub鎖形成機構の理解」(in vivo)：
細胞内環境のpHを解析する方法はいくつか検討中であるが、まずは培養液のpHによっても核酸促進型K63Ub鎖形成に影響がでるかどうかの検討を行った。pHを変えてからの時間も数点検討し、まずはバルクのK63Ub鎖量の変化を解析した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

in vitroおよびin vivoにおける解析の条件検討を進めることができ、今後の本解析に進む道筋ができた。特に高速AFMでの観察条件が決まったことが大きい。また核酸結合部位候補と種保存性との照らし合わせから、候補の絞り込みが可能となった。今後の発展が期待できる。

Strategy for Future Research Activity

順調であるため、当初の研究計画に沿って今後も研究を推進できると考えている。in vivoの解析には時間がかかりやすいため、できるだけin vitroと平行して進めていくことが必要である。