2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of mechanisms for recognition of natural substrate and its structure-function alternation by peptidylarginine deiminase
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19K06507
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
海野 昌喜 茨城大学, 理工学研究科(工学野), 教授 (10359549)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | S100A3 / 蛋白質アルギニン脱イミノ化酵素 / 変異体 / 構造 / X線 / アイソザイム / 阻害剤 / PAD3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
毛髪の最外層を形成しているキューティクルの中には、シトルリン化という翻訳後修飾を受けたS100A3タンパク質（S100A3）が豊富に含まれている。このシトルリン化を担うのがタンパク質脱イミノ化酵素（PAD）のアイソザイムの１つPAD3によって主に行われていると考えられている。毛髪に発現するPAD1, PAD2, PAD3の中で、PAD1, PAD2はS100A3の4つ全てのアルギニンをシトルリン化するが、PAD3はArg51のみを選択的にシトルリン化する。このシトルリン化により通常二量体で存在するS100A3は、Ca2+, Zn2+存在化で四量体に構造変化をしつつ、それぞれのイオンに対する親和性を協同的に上昇させる。このPAD3の特異な基質選択機構やS100A3のダイナミックな構造変化機構を解明するために、X線や物理化学的な手法を使って分子構造に関するデータを収集した。
今年度の成果は、S100A3のArg51Gln1変異体が、PAD3によりシトルリン化を受けたS100A3の物理化学的性質や生化学的性質が最も類似していることを見出した。また、PAD3の６つの状態の構造をX線結晶構造解析により決定し、それぞれの構造の比較や他のアイソザイムの構造との比較から、活性部位の構造の違いを見出した。さらに、試験管内でS100A3に対して、毛髪には発現しないPAD4を使ったシトルリン化反応を行ったところ、PAD3と類似の基質特異性や反応性を示した。PAD4はPAD3と同様に、S100A3のArg51を選択的にシトルリン化することを見出した。さらに、阻害剤Cl-amidineとの相互作用様式を解明した。PAD4に存在しているArg374がPAD3ではGly374に変わっているため、その部位の相互作用がなくなり、非常にルーズになっていることがわかり、生化学的なデータと一致した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
S100A3の変異体の作成に成功し、その物理化学的・生化学的な性質を調べ、天然の酵素であるPAD3によってシトルリン化されたS100A3の性質と比較することで、この変異体がシトルリン化S100A3のモデルとなり得ることを示した。これは今後の研究に対して大きな前進を与えたと考えている。一方、当初予定していた四量体化成分の高純度単離はうまくいっていないため、四量体の構造解析は難航している。ゲル濾過分析の結果、四量体は形成しているが、二量体成分も多く残っており、平衡が存在しているようであり、これらをできるだけ単一のピークにするような条件を探索することが今後の課題と言える。
PAD3-S100A3複合体化についてはまだ進行していないが、研究の過程で、阻害剤複合体の解析やPAD3の不活性型の解析ができたことは大きな進展であり、今後の研究に弾みをつけた。PAD3とPAD4が似ていることを示したが、詳細な解析によって、その２つのアイソザイムを見分けられるような阻害剤な設計も可能な段階である。S100A3のシトルリン化反応は、我々の精製したPAD3タンパクでも確かに進行することは様々な条件により確実に示すことができた一方で、S100A3との複合体化を確認する作業が滞っている。
PAD3が自己シトルリン化していることを見出し、現在、その部位を特定しようとしている。当初、ESI-MSやMALDI-TOF-MSを用いて同定を試みた。今後詳細な解析を継続していく予定である。
予想以上に進行した部分もあれば、研究計画通りに進んでいないこともあり、「おおむね」順調に進行している、を選択した。
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| Strategy for Future Research Activity |
PAD3はS100A3のArg51を選択的にシトルリン化する酵素である。この基質選択性は毛髪に発現する他のアイソザイムPAD1, PAD2と異なる。この選択性の違いを原子レベルで解明するのが目的の一つであり、今まで研究を進めてきた。PAD3の６つの状態を解析し、PAD1やPAD2との構造の違いを解明することができたが、この基質選択性の違いは、これらの構造からだけでは明確に解明できたとまではいかない。そのため、今後、さらに理解を深めるために、S100A3とPAD3の複合体の立体構造解析を目指すが、アプローチとして今までの方向性ではあまりうまくいっていなかったため、リンカーのような人工的な仕組みを一つ導入することも視野に入れている。また、X線結晶構造解析に拘らず、クライオ電顕を使った解析を推進する。
S100A3の四量体の単離は、従来の方法では難しいが、本研究の中で見出した変異体が明るい道筋を照らしてくれている。論文で報告したR51Q変異体に加え、R51Q+R77Q変異体の四量体化も進める。さらに、2011年のJMBで報告したシステイン変異体を導入することで、四量体化はさらに進むことが予想されるので、それらを組み合わせたマルチサイト変異体の物性を調べながら、構造解析を行いたい。
さらに、本研究課題の遂行の際に見出した、自己シトルリン化サイトはLC-/MS/MSなどを使って、確定的にしたいと考えている。自己シトルリン化サイトを見出したら、その部位の変異により、PAD3の活性や基質特異性がどのように変化していくかについても解析する。共同研究により、さらに細胞や動物への導入により、原子レベルの解析から細胞・組織・個体レベルでの解析へと進んでいきたい。
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| Causes of Carryover |
放射線バッジの金額などの支出の誤差から、1377円の差額が出た。
令和3年度の経費と併せて消耗品に使用する予定である。
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[Journal Article] Structures of human peptidylarginine deiminase type III provide insights into substrate recognition and inhibitor design2021
Author(s)
Kazumasa Funabashi, Mizuki Sawata, Anna Nagai, Megumi Akimoto, Ryutaro Mashimo, Hidenari Takahara, Kenji Kizawa, Paul R.Thompson, Kenji Ite, Kenichi Kitanishi, Masaki Unno*
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Journal Title
Archives of Biochemistry and Biophysics
Volume: 708
Pages: 108911
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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