2021 Fiscal Year Research-status Report

Molecular basis of 3'-5' polymerase in a diverse RNA recognition

Research Project

Project/Area Number	19K06519
Research Institution	National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Principal Investigator	中村彰良国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (10583891)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	X線結晶構造解析 / tRNA修飾 / アミノアシルtRNA合成酵素 / DNA/RNAポリメラーゼ / 核酸 / タンパク質 / 鋳型依存伸長反応 / 逆向き重合
Outline of Annual Research Achievements	核酸合成を担う酵素は全て5′-3′方向に塩基伸長するというのは長らく定説であったが、逆向きの3′-5′方向へ塩基伸長する酵素Thg1が発見され注目を浴びている。しかし、なぜThg1には逆方向の塩基伸長活性が現存するのか、その生物学的意義の解明には至っていない。最近Thg1がtRNA以外の多様なRNAを認識することが示唆されているが、未だ生体内RNAは同定されておらず、Thg1がどのように多様なRNAを認識するか不明である。本研究では、ランダムRNAライブラリーから Thg1の基質となりうる新規RNAを探索し、Thg1との複合体の構造解析を行うことで、Thg1のRNA認識における多様性を解明することを目的としている。 2021年度は、機能解析を行い論文発表したヒトThg1のtRNAHis成熟におけるヌクレオチド認識機構（Nakamura A., et. al., (2021), RNA, 27(6) 665-675)をさらに発展させ、シロイヌナズナが有する2種類のThg1の機能解析に取り組んだ。過去の報告から、シロイヌナズナの2種類のThg1の欠損体の表現型が異なることから、生体内で別の機能を有することが示唆されている。本研究ではこれまでに、Thg1-1およびThg1-2を欠損したシロイヌナズナの表現型を確認し、すでに報告のある熱感受性を再現することができた。また、大腸菌発現系を用いてThg1-1は大量調製が可能であることを見出した。今後は両者の反応機構の違いから、Thg1のtRNA成熟以外の生体内機能の同定を試みる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度はヒトThg1の生化学実験とミトコンドリアtRNAとの複合体の結晶構造をまとめ、論文発表した。さらに、機能が異なることが予想されるシロイヌナズナの2種類のThg1の機能解析に取り組み、サンプル調製など順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	ヒトThg1とランダムスクリーニングで取得したRNAとの共結晶構造解析を進め、その複合体構造からThg1のtRNA成熟以外の機能の同定を試みる。さらに、機能が異なるとされるシロイヌナズナの2種類のThg1の機能解析を進め、その反応機構の違いから新たな機能を推定する。
Causes of Carryover	COVID-19による出勤制限、移動制限により研究遂行および成果発表が計画通りに行うことができなかった。次年度は学会発表などの成果発表への使用を計画している。