グループⅣ[NiFe]ヒドロゲナーゼの水素合成-プロトンポンピング共役機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06521
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 庄村 康人 茨城大学, 理工学研究科(工学野), 准教授 (50423900)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 水素合成酵素

Outline of Annual Research Achievements

本研究は，[NiFe]ヒドロゲナーゼの中でも特に構造や機能の理解が進んでいないグループⅣ[NiFe]ヒドロゲナーゼに着目し，X線結晶構造解析によって①本酵素の作動原理ならびに酸素抵抗性および水素分解・合成バイアス決定要因を原子レベルで理解すること，および②進化的に類縁するエネルギー代謝複合体とのメカニズムや構造における共通点と相違点を明らかにすることを目的とする．
これまでの研究では，解析に十分な純度と量の標的タンパク質試料を調製することが困難であるという問題が未解決であった．そこで2019年度は，収率増大のためのアフィニティータグのゲノムへの挿入の検討，およびそのための遺伝子組換え技術の確立を重点的に行った．標的タンパク質を産生する高度好熱菌は，これまで液体培養のみで増殖させてきたが，遺伝子組換え体の作製には寒天培地を用いた培養によるコロニー選択の過程が不可欠であるため，その条件を検討した．また，同様に不可欠な，抗生物質耐性の確認，その有効濃度の決定，および耐性マーカー遺伝子の選別を行い，カナマイシン耐性遺伝子が選択マーカーとして最適であるという結論を得た．続いて，アフィニティータグとしてヒスチジン繰り返し配列を可溶性サブユニットのC末端に挿入するカセットを設計および合成し，相同性組換えによって組換え体高度好熱菌を作製した．得られた複数のコロニーについてPCRによってゲノムへのタグ挿入を確認したところ，ほぼ全てのコロニーにおいてタグの挿入が認められた．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまで試料の大量調製が研究遂行のボトルネックとなっていたが，当該宿主の遺伝子組換え技術の確立により，この問題が解決できると期待される．また，本研究の最終目標である構造機能相関の解明には部位特異的変異体の調製が極めて有用であるが，この技術はその変異体の調製にも生かされる．このように，2019年度の研究成果は抜本的な問題解決への糸口を見出すものであり，これによって本研究は大きく進展したといえる．

Strategy for Future Research Activity

2020年度は，まず前年度に行ったアフィニティータグの有用性を評価する．それには，遺伝子組換え体高度好熱菌の培養を行い，アフィニティーカラムによる粗精製を試み，溶出画分の活性測定およびSDS-PAGEによる純度の確認を行う．もしタグの挿入による菌体重量あたりの活性や比活性の低下が見られるようであれば，タグの位置の再検討を行う．十分な純度と収率が認められれば，大量培養および精製を行い，標的タンパク質試料を得る．
また，現時点では，組換え体ゲノムにはカナマイシン耐性マーカーが挿入されたままの状態であるため，続けて変異導入を行うことができない．そこで，マーカーを削除する技術の確立や，耐性マーカーを必要としないCRISPR-Cas9を用いたゲノム編集の系を確立することによって，この問題の解決を試みる．

Causes of Carryover

理由：残額が細かすぎて使い切れなかったため．
使用計画：次年度の助成金と合わせて，精製のための試薬の購入に使用する．