2020 Fiscal Year Research-status Report
革新的なクロマチン基盤膜を用いたクライオ電子顕微鏡3次元構造解析
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19K06522
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
滝沢 由政 東京大学, 定量生命科学研究所, 准教授 (00434291)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | クロマチン / ヌクレオソーム / クライオ電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クロマチンは、ヌクレオソームと呼ばれるヒストンとDNAの複合体を最小単位として核内に収納されている。滝沢は、結晶化が困難な試料溶液をグリッド上で急速凍結し観察することのできるクライオ電顕鏡解析を使い、ヘテロクロマチン基本構造やネイティブDNA配列を含むヌクレオソームの3次元構造を明らかにしてきた。クライオ電子顕微鏡解析は、近年様々な技術革新により、画像取得やコンピュータ解析の自動化、高速化が行われてきたが、急速凍結試料グリッド作製には、複合体精製の難しさや凍結条件の最適化など多くの課題が残されている。本研究では、クライオ電子顕微鏡を用いたクロマチン構造解析における急速凍結試料作製の効率化、高品質化および今まで構造解析が難しかったクロマチン複合体や高次クロマチンの可視化を実現するため、クロマチン基盤膜グリッドの作製を目的としている。2020年度は、クロマチン基盤膜グリッドに固定するための多様なクロマチンの作製を引き続き行った。成果として、パイオニア転写因子GATA3とヌクレオソーム複合体構造 (Tanaka, Takizawa et al, Nature Commun, 2020), 自然免疫に関与するcGAS-ヌクレオソーム複合体構造 (Kujirai,...Takizawa et al, Science, 2020)、ヒストンH4メチルトランスフェラーゼSET8-ヌクレオソーム複合体構造 (Ho, Takizawa et al, Life Sci Alliance, 2021)をクライオ電子顕微鏡単粒子解析により明らかにした。また、基盤膜グリッドとして、単層グラフェンを貼ったグリッドの作製を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
2020年度は、クロマチン基盤膜グリッドに固定するための様々なクロマチンの作製を行った。特に、パイオニア転写因子GATA3とヌクレオソーム複合体構造 (Tanaka, Takizawa et al, Nature Commun, 2020), 自然免疫に関与するcGAS-ヌクレオソーム複合体構造 (Kujirai,...Takizawa et al, Science, 2020)、ヒストンH4メチルトランスフェラーゼSET8-ヌクレオソーム複合体構造 (Ho, Takizawa et al, Life Sci Alliance, 2021)をクライオ電子顕微鏡単粒子解析により明らかにした。解析を行った試料は、クロマチン構造の制御に重要な役割を果たしていると考えられ、これらのクロマチンを基盤膜グリッドに固定することができれば、これらの複合体上に更に結合する様々なクロマチン結合因子をグリッド上で結合させることができ、クロマチン構造の理解が進むことが期待される。また、2020年度は、基盤膜グリッドとして、単層グラフェンを貼ったグリッドの作製を試みた。電子顕微鏡により単層グラフェンがグリッド上に高効率で張られていることを確認した。また、作製できた単層グラフェングリッドにヌクレオソームを結合させることにより、低濃度のヌクレオソームのクライオ電子顕微鏡観察に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
クロマチン基盤膜グリッドに結合させるクロマチンとして、モノヌクレオソームだけではなく、ジ、トリヌクレオソームに加えてネイティブDNA配列を含むヌクレオソームを精製する。また、ヌクレオソームとその結合因子の精製も引き続き行い、ヌクレオソームとその複合体を精製後、クライオ電子顕微鏡単粒子解析による立体構造解析を促進する。また、クロマチン基盤膜グリッドに結合させるためのヌクレオソームは、ビオチン化DNAまたはタンパク質タグを付加したヒストンを用い、基盤膜グリッドへ効率良く結合できる条件を検討する。基盤膜グリッドは、2020年度に作製したストレプトアビジンモノレイヤーグリッドおよび単層グラフェンを中心に検討する。2020年度、単層グラフェングリッドにヌクレオソームを結合させることにより、低濃度のヌクレオソームのクライオ電子顕微鏡観察に成功している。今後は、単層グラフェングリッドにNi-NTA脂質単層膜を張ることにより、特異的にヌクレオソームを結合させたグリッドの作製を行う。また、良質な凍結グリッドを作製するため、試料濃度、バッファー条件、急速凍結装置の条件等の検討を行う予定である。最適化された急速凍結条件が決まり次第、クライオ電子顕微鏡での大量画像取得およびコンピュータによる単粒子解析を行い立体構造を得ることにより、基盤膜グリッド上でのヌクレオソームの形状を評価する。
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