HCV IRESによるヒトリボソーム・ハイジャック新機構の構造生物学的解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06533
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 岩崎 わかな 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 専任研究員 (00332289)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: リボソーム / 電子顕微鏡 / ウィルス

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、HCV IRESが下流の遺伝子を宿主リボソームに翻訳させる過程において、HCVゲノムの3’UTRおよび翻訳開始因子eIF3が担う役割を調べた。
まず、HCV IRES配列にGFP遺伝子および3’UTR配列を連結したRNAを調製した。in vitro再構成系、およびCell extractを用いた無細胞翻訳系を用いて、3’UTR配列の有無により翻訳産物の量が変わるか調べた。また、再構成系において、共存させる開始因子の種類・組み合わせによる効果も調べた。しかし、再構成系では多数の精製因子の保存状態の影響が積み重なるため、定量可能な翻訳産物量を再現性良く得つつ、添加因子の組み合わせによる翻訳量の増減を見極めることは困難であった。
並行してクライオ電子顕微鏡により機能複合体の構造解析も試みた。HCV IRESの下流にPAタグおよび翻訳を停止させるuORF2配列を入れ、Cell extractを用いた無細胞系にて翻訳反応させた。PAタグを用いて翻訳停止状態のリボソームを精製し、western blotしたところ、精製画分中にeIF3が検出された。HCV IRESによる翻訳において、eIF3は必要と考えられているが、既報のCSFV IRES (HCV IRESに類似)/リボソーム40S/eIF3複合体の電子顕微鏡構造では、eIF3がIRES依存的な翻訳に寄与する機構を説明することは難しい。活性測定と立体構造の両方向から翻訳過程を明らかにするため、HCV IRES/リボソーム/eIFs複合体の構造解析に着手した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

活性測定については引き続き条件検討が必要だが、クライオ電子顕微鏡による構造解析については、現在のところ大きな問題はなく試料調製を進めている。

Strategy for Future Research Activity

昨年度は翻訳開始因子の役割を明らかにするため、クライオ電子顕微鏡により、翻訳開始因子との複合体の解析を行った。得られたデータでは、翻訳開始因子と思われるマップが弱いながら見えていたが、分子モデルを置くのは困難であった。今後は、活性測定を行いつつ、架橋や因子の組み合わせなどを検討して試料調製を行い、活性状態を反映した複合体の調製を試みる。昨年度に引き続き、無細胞再構成系で活性測定を行い、条件検討を行う予定である。得られた複合体の構造情報を参考に、活性測定の条件を見直し、構造・活性の双方向から翻訳機構の解明を目指す。
並行して、HCV IRESだけでなく、翻訳に関わる他のウィルスのRNA配列についても検討を行う予定である。

Causes of Carryover

学会参加費および旅費が不要となったため。また、今年度は電子顕微鏡解析が主となり、一分子蛍光イメージング実験を行わなかったため、一分子実験用に予定していた費用が不要となったため。