2020 Fiscal Year Research-status Report

Physiological significance of phospholipid asymmetry in Golgi membranes

Research Project

Project/Area Number	19K06536
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	田中一馬北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (60188290)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	三岡哲生北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (60754538) [Withdrawn] 岸本拓磨北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (70585158)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2024-03-31
Keywords	脂質非対称性 / フリッパーゼ / ゴルジ体 / 小胞輸送 / 酵母
Outline of Annual Research Achievements	生体膜の脂質二重層では脂質が非対称に分布しているが、その生理的意義には不明な点が多い。私達は、出芽酵母をモデル系に用いて、脂質非対称性の形成に重要な役割を果たすフリッパーゼ（4型P-type ATPase）の機能に焦点を当てて解析している。一方で私達は、ゴルジ体に局在するNeo1フリッパーゼ変異の致死性を抑圧する変異遺伝子として新規のゴルジ膜タンパク質Cfs1を見出している。Cfs1は酵母からヒトまで保存されているが、機能は明らかにされていない。そこで本研究では、Neo1とCfs1が制御するゴルジ体の諸機能を明らかにすることにより、ゴルジ体膜における脂質非対称性の生理機能を解明する。本年度は次の成果を得ている。合成致死変異スクリーニングにより，cfs1 変異がlem3 sfk1二重変異と合成致死になることを明らかにした。Lem3は細胞膜で働くDnf1/Dnf2フリッパーゼの非触媒サブユニットであり，またSfk1はフリッパーゼとは異なるが脂質非対称性制御への関与が示唆されている細胞膜タンパク質である。そこでcfs1 lem3 sfk1三重変異株を作成し，その表現型について解析を行った。Cfs1がゴルジ体やエンドソームに局在することから，ゴルジ体が関連する小胞輸送経路について解析を行ったところ，細胞膜からエンドソーム，ゴルジ体を経て細胞膜へとリサイクルされる，エンドサイトーシス-リサイクリング経路に障害が生じていることを見出した。すなわち，cfs1 lem3 sfk1三重変異株では，リサイクルされるべきカーゴタンパク質がエンドソームからゴルジ体ではなく液胞（vacuole）へと誤輸送されることを明らかにした。従って，細胞膜の脂質非対称性異常がゴルジ体やエンドソームの脂質非対称性異常と重なることにより，リサイクリング経路に障害が生じることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究ではゴルジ体膜の脂質非対称性制御の生理的意義について、酵母の遺伝学的手法を中心に用いて解析する。本研究で用いたNeo1を含めて、フリッパーゼはゴルジ体膜脂質二重層の内腔側層のリン脂質を細胞質側層へ輸送することにより膜脂質非対称性の形成を促進する。Cfs1はNeo1やDrs2フリッパーゼ欠損変異の抑圧変異として単離された遺伝子であるが，その機能については不明である。前年度の研究ではneo1 cfs1変異と合成致死となるerd1変異を見出し，Erd1がゴルジ体のリン酸イオンホメオスタシスに関与することが示されていることから，ゴルジ体の脂質非対称性とイオンホメオスタシスとの関係性について報告した。今回，その活性等が不明であるCfs1の新たな機能を探るため，遺伝学的スクリーニングを行い，Cfs1が，細胞膜タンパク質であるLem3-Dnf1/Dnf2フリッパーゼ遺伝子及びSfk1遺伝子と遺伝学的に相互作用することを見出した。cfs1 lem3 sfk1三重変異株ではエンドサイトーシス-リサイクリング経路に障害が生じていたが，この結果は，主としてゴルジ体に局在するCfs1が，細胞膜脂質非対称性の制御因子とも機能的に相互作用することを示しており，新規の知見である。cfs1 lem3 sfk1三重変異株の解析から，エンドサイトーシスされたカーゴタンパク質がリサイクリング経路により認識されずにそのまま液胞へ誤輸送されている可能性が示唆された。従って，脂質非対称性の制御がカーゴの認識に働いている可能性が考えられ，新しいメカニズムの存在が考えられる。
Strategy for Future Research Activity	本研究ではNeo1をはじめゴルジ体に局在するフリッパーゼ変異の抑圧変異として単離されたCfs1が，細胞膜に局在するフリッパーゼとも機能的に関連することを明らかにした。Cfs1は酵母からヒトまで保存されるPQ-loopファミリーに属する７回膜貫通タンパク質であり，その生化学的な機能は不明であるが，複数のフリッパーゼと機能的に相互作用することから，何らかの形で脂質分布の制御に関わっている可能性が考えられる。今後は，今回単離したcfs1 lem3 sfk1三重変異株において，脂質を可視化する様々なプローブを用いて細胞内脂質分布について解析を行い，Cfs1の脂質非対称性をはじめとする膜脂質分布制御への関与について解析を進める。一方，前年度の本研究では，neo1 cfs1変異が，ゴルジ体の内腔から細胞質へリン酸を輸送することが示唆されているErd1の変異と遺伝学的に相互作用し，neo1 cfs1 erd1変異株においてゴルジ体からの小胞輸送に欠損が生じることを明らかにした。従って，Neo1およびCfs1が脂質の非対称性制御を介してゴルジ体のイオンホメオスタシスに関与している可能性が考えられ，この点についても解析を進めて行く。
Causes of Carryover	242,921円の繰越が生じた。次年度も、研究分担者分も含めて、培地，合成オリゴDNA、一般研究試薬、分子生物学関連試薬，プラスチック器具等に使用する予定である。