2020 Fiscal Year Research-status Report
イオウ依存型エネルギー代謝を基盤とした低酸素耐性機構の解析
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19K06537
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
笠松 真吾 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (80738807)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 活性イオウ分子 / 低温耐性 / レドックスシグナル / ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトを含むほとんどの哺乳類は非冬眠性動物であり、低酸素・低温環境に曝露されると細胞や組織は傷害され、最終的に死に至る。一方で、ジリスやハムスターなどの冬眠性動物は、低酸素・低温耐性を持つことが知られている。しかし、その分子生理機構の詳細は不明な点が多く残っている。本研究では、ミトコンドリア内で生成されるイオウ代謝物（活性イオウ分子種）によるミトコンドリアエネルギー代謝機構（イオウ呼吸）の低酸素・低温下における役割を解析し、イオウ呼吸と低酸素・低温耐性および冬眠の連関について解明する。
活性イオウ分子種は非常に高い反応性を持ち不安定な物質であるため、そのままの状態で特異的かつ高感度に検出することは非常に困難である。我々はこれまでに、アルキル化試薬を用いて活性イオウ分子を安定な誘導体へと変換した後、質量分析装置にて検出する絶対定量系を構築してきた。当該年度は、新規に開発した活性イオウ分子分解抑制効果を持つアルキル化試薬（N-iodoacetyl tyrosine methyl ester, TME-IAM）を用いた絶対定量系を構築した。この解析系を用いて、低温環境下で飼育したC57BL/6マウスの肝臓内活性イオウ分子レベルを解析した結果、低温飼育群でグルタチオンパースルフィドの有意な増加が認められた。ウェスタンブロット法を用いて活性イオウ分子代謝関連酵素発現レベルを解析した結果、低温曝露群において、生体内活性イオウ分子生成における主要な酵素であるミトコンドリア局在型システインtRNA合成酵素の発現レベルの有意な増加が確認された。これらの結果は、低温環境応答に生体内活性イオウ分子生成動態が連関している可能性を示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題研究において、低酸素・低温耐性および冬眠実現機構の解明に向けた研究を展開している。これまでに既存の試薬よりも優れた活性イオウ分子分解抑制をもつ新規アルキル化試薬（N-iodoacetyl tyrosine methyl ester, TME-IAM）の合成および、新規活性イオウ分子定量系の開発に成功した。当該年度では、研究実施計画に沿って、低温曝露マウス生体内における活性イオウ分子代謝について解析した。その結果、低温曝露によって、マウス肝臓内の活性イオウ分子種量の増加が示され、加えて、活性イオウ生成酵素発現量の上昇も確認された。従って、マウス生体内において、低温環境適応に生体内活性イオウ代謝系の活性化が関与している可能性が示唆された。また、還元剤とN-ethylmaleimideを用いた全活性イオウ分子量の定量系および、TME-IAMを用いた未知活性イオウ分子の網羅的探索系を新たに構築した。これらの解析系を組み合わせることにより、低温耐性と生体内活性イオウ分子生成動態の連関の詳細を解析することが可能である。また、シリアンハムスター細胞内活性イオウ代謝遺伝子ノックダウンプラスミドの作製を完了しており、活性イオウ代謝遺伝子ノックダウンによる低温耐性や細胞内活性イオウ分子生成動態への影響を解析する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、冬眠性哺乳動物であるシリアンハムスターを低温曝露し、その生体内活性イオウ生成動態への影響を、本研究課題で開発したTME-IAMを用いた絶対定量系にて解析する。また、TME-IAM標識抗体を作製する。TME-IAMを用いたタンパク質ポリスルフィド検出系を構築するとともに、抗TME-IAM抗体を用いた活性イオウ分子のイメージング解析法を構築する。さらに、同抗体を用いた免疫沈降法にて、活性イオウ化タンパク質の検出・同定を目指す。これらの解析を行うことによって、また、活性イオウ関連遺伝子改変マウスを低温曝露し、その動物組織内における活性イオウ分子種生成動態を解析することで、低温耐性機構における活性イオウ分子生成系の寄与を検討する。さらに、前述した新規アルキル化試薬によるイオウメタボローム・プロテオーム解析系を用いて、低温曝露により変動する未知活性イオウ分子の探索を行うことで、低温耐性機構における活性イオウ分子の機能の解明を目指す。
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