ユビキチン化を介したβ1インテグリンの抑制機構とがん悪性化への関与

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06544
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 坂本 泰久 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (20613392)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Nedd4L / インテグリン / ユビキチン化

Outline of Annual Research Achievements

がん細胞の異常な増殖、生存、運動はがん悪性化の原因となる。これには細胞接着分子インテグリンの活性化が関与する。本研究ではユビキチン化酵素Nedd4Lによるインテグリンβ1の下方制御機構、そしてその破綻によるがん悪性化の仕組みを解明する。
初年度の研究成果から、Nedd4Lはがん細胞の増殖と運動を抑制すること、そのメカニズムとしてエンドサイトーシスを介して細胞表面のインテグリンβ1の活性化を抑制することを示した。さらにフィブロネクチンによるインテグリンα5β1の刺激によってNedd4Lの活性化指標となる自己ユビキチン化が増加することを明らかにした。
本年度は、さらに上皮成長因子（EGF）によるEGF受容体の刺激によってもNedd4Lが活性化することを見出した。そこで活性化機構の詳細を明らかにするため、リン酸化によるNedd4L活性制御の可能性を検討した。細胞を刺激後、免疫沈降したNedd4Lを質量分析によって解析したところ、複数のリン酸化部位が同定された。刺激依存的にリン酸化されたセリン残基に着目し、疑似リン酸化となるアスパラギン酸に置換したNedd4L変異体を作成したところ細胞内において恒常的な活性化がみられた。以上のことからNedd4Lはインテグリンα5β1やEGFRが刺激をうけるとリン酸化され、活性化されることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

変異型Nedd4Lの活性化を評価する過程で、細胞でのNedd4Lの過剰発現が必要になったが、内在Nedd4Lと一部挙動が異なることが判明し、安定した実験条件の検討に予想以上の時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

本研究の目的は、Nedd4Lがユビキチン化を介してインテグリンα5β1を下方制御し、がん細胞の増殖と運動を抑制する機構を明らかにすることである。我々は、Nedd4Lの活性化機構に着目し研究を進めてきた。そして今回、リン酸化による新規活性化機構の端緒を得た。
今後はNedd4Lの活性化機構の全貌を解明する。そのため、最初に精製Nedd4Lタンパク質を用い、リン酸化による活性化をin vitroで確認する。そしてNedd4Lがリン酸化によって分子内相互作用を解放し、ユビキチン化酵素活性を上昇させる仕組みを明らかにする。さらにリン酸化に関わるシグナル伝達経路、責任酵素を明らかにする。
リン酸化によってNedd4Lを活性化することが明らかになったEGFRは、インテグリンα5β1と協調してがん細胞の増殖と運動を促進する。そこでNedd4Lを介したEGFRとインテグリンα5β1のシグナル伝達のクロストークを明らかにする。

Causes of Carryover

新型コロナの感染防止のため、予定していた県外への出張の取りやめになり予算を使用しなかった。さらに在宅勤務を行う時間があり一部の実験の進捗が滞った。次年度に計画的に利用する。