2019 Fiscal Year Research-status Report
光学的p38活性制御により明らかになる細胞増殖抑制シグナルの時間情報コーディング
| Project/Area Number |
19K06548
|
|---|
| Research Institution | Toho University |
|---|
Principal Investigator |
冨田 太一郎 東邦大学, 医学部, 講師 (70396886)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | ストレス / 可視化 / p38MAPK |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、代表的なストレス応答シグナルであるJNKおよびp38MAPKに着目し、特に細胞の増殖抑制に作用するMAPK活性を光照射により自在に制御する新しい手法を実現し、これを用いてがん細胞の増殖および細胞死へのストレス応答MAPKの関与を解明する。抗がん剤等の各ストレスにより惹起される細胞内ストレス応答シグナルには、単なる活性上昇以外にも、時間や細胞内局在の変化を伴う。このような時間や空間に依存した変化にはさまざまな変動パターンがあるため、そのパターン依存的な細胞応答が生じる可能性およびその機序、生理的意義を探ることを狙った。
本年度は、まず、FRET型p38MAPKおよびJNK活性可視化イメージングと光によるMAPK活性操作系とを同一の細胞で実現する系の作成を試みた。しかし、光操作系とFRET測定系に用いる照射光が相互に干渉する問題が生じた。そこで光照射なしでFRET測定を可能にする発光型のFRET実験系によるp38MAPK可視化系を新規に構築したところ、実際にHeLa細胞で光照射をせずにストレス依存的なp38MAPK活性上昇を測定することを確認できた。さらに、JNKとERKについても、同様の活性可視化系を構築しその活性を確認した。光操作に関しては、光操作系をトランスポゾン活性を用いて細胞株に安定発現させる発現用コンストラクトを作成した。また、ストレス負荷を受けた細胞では、p38αがMAP2Kによりリン酸化されて活性化を受けるが、ストレスによるp38αの活性化機構をFRETレポータで解析したところ、リン酸化部位以外の変異であっても、特定の変異を持たせた場合には、細胞内のbasalのMAP2Kの活性だけでも十分にp38αが活性化状態になることを見い出し報告した(EMBOJ)。以上、本年度は光操作とp38MAPK活性測定を同一の細胞系で行うための基盤技術を確立した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当年度の目標として、p38MAPK活性の可視化および光活性化実験系の構築をめざした。FRET系は既に確立していたが、これをさらに、光操作と同時に行うための可視化系として発展させて、光照射せずにp38MAPK活性を光学測定可能にする新規のFRET-BRET観察系（発光型FRET）を構築できた。また、光操作実験系についても必要なコンストラクトを作成しており、当初の予定通り進んでいるといえる。またストレス応答の際に生じるp38の制御機構については、FRETイメージングを用いた解析を進めた結果、哺乳類p38αの活性化をおこす新たな分子内変異を同定することができ、上流からのリン酸化制御とは別の機構によってp38MAPK活性を調節可能であることがわかったため、これらの成果の一部を論文に発表した(EMBOJ 2020)。今後、ストレス応答シグナルについては、その動的な挙動ががん細胞の抑制等にどのように関連するかは別途検証する必要はあるが、p38MAPKが関わる炎症や細胞増殖抑制に関わるメカニズムとして新しい機序となる可能性が見出された。以上から、本研究は当初の計画に沿っておおむね順調に進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
新しい測定方法によるp38MAPK活性可視化系およびp38MAPK活性の光操作系を用いて、p38MAPK活性の変動が細胞増殖シグナルに及ぼす作用を解明する。特に、p38MAPK活性の時間変動パターンを光操作等により変化させ、その結果生じる細胞応答の変化から、p38MAPKの活性変動がもたらす生理機能を探る。特に、細胞周期制御および細胞死制御を行う分子メカニズムについてはがん増殖抑制の主要な標的となるため、抗がん剤等に代表される各種ストレスで惹起されるp38MAPKの変動パターンの生理的意義の解明を進める。実際に、がん由来培養細胞系において可視化と操作の同時実験系を作製して、同様の効果が認められるか検証する。以上から、ストレス依存的な細胞内シグナル動態の解明およびそれが増殖抑制に寄与するメカニズムの理解をめざす。
|
| Causes of Carryover |
ほぼ予定通りの支出総額であるが、消耗品購入の際に業者の行うキャンペーン割引があり残金を生じた。残金の使用計画として、次年度に計画している細胞培養実験および観察実験には、物品費としてプラスチック器具、細胞培養試薬、光学機器消耗品が必要であるが、このうち、プラスチック消耗品として購入予定の観察用培養皿が価格改定で値上がりしているため、本年度生じた残金は物品費に充当する計画である。
|
