2020 Fiscal Year Research-status Report
Do GTPase activating protein ArfGAPs perform "shipping inspection"?
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19K06557
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
芝 陽子 岩手大学, 理工学部, 准教授 (50755866)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ArfGAP / SMAP1 / AGFG2 / vWF / WPB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までにSMAP1とAGFG2というArfGAPをヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)におけるWeibel-Palade Body (WPB)の形状に関与するとして同定した。WPBのサイズを定量したところ、SMAP1knockdown(KD)細胞ではWPBのサイズが短くなった。AGFG2KD細胞ではvWF染色時に一次抗体のインキュベート時間を長くすると長いWPBが観察可能になり、サイズの変化はなかった。HEK293細胞を用いてSMAP1のknockout(KO)細胞株を作成したところ、偽WPBのサイズが小さくなりsiRNAによるオフターゲット効果ではないことが確認できた。ELISA法によってvWFの分泌量を測定したところ、AGFG2KD細胞でPMA刺激時のvWF分泌量が減少した。AGFG2KD細胞では免疫染色でPMA刺激後もWPBが細胞内に多く残っていた。AGFG2KD細胞にAGFG2を過剰発現させるとPMAの有無にかかわらずWPBが細胞内から減少し、vWF分泌が回復した。分泌vWFの多量体化、細胞内vWFの切断量、分泌顆粒マーカーRab27とWPBの共局在をSMAP1およびAGFG2KD細胞で調べたが、大きな変化がなかったことから、WPBの成熟に大きな変化はないと考えられる。SMAP1KDおよびKO細胞をリソソームの酵素を阻害するロイペプチンで処理したところWPBのサイズが回復したことから、SMAP1は通常長いWPBの分解を阻害しており、欠損によって長いWPBが分解され短いWPBのみ残ったと考えられる。SMAP1が分泌顆粒の分解に、AGFG2が刺激依存性分泌に関与するという報告はこれまでなく、現在論文を投稿中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在論文を投稿中なので、概ね順調に推移している。(査読前の投稿論文がBioRxiv doi: 10.1101/2021.03.29.437631で閲覧可能)。本来の目的であったWPBの形成に関与するArfGAPはここでは発見できなかった。しかしArfGAPファミリーのうち、SMAP1がWPBの分解を抑制していること、AGFG2がvWFの分泌に関与すること、はこれまで報告されておらず、新規性が高い。元の予定ではGAP活性について詳細に調べる予定であった。GAP活性を欠損させる変異体をSMAP1とAGFG2でそれぞれ作成し( SMAP1[R61Q], AGFG2[R75Q])、HUVECに過剰発現させたが、SMAP1の過剰発現では野生型、変異体ともにゴルジ体が壊れてしまい、ポストゴルジの表現型を解析することができなかった。またAGFG2も、野生型、変異体の過剰発現ともにWPBが細胞内から減少し、vWFが分泌されてしまった可能性がある。AGFG2についてはGAPドメインの配列が必ずしも保存されていないことから、もともとGAP活性がない可能性も考えられている(Schlacht et al., Traffic, 14, 636-649,2013)。したがって、少なくともAGFG2については、GAP活性がvWFの分泌に必ずしも必要でない可能性がある。またSMAP1については、過剰発現ではない解析法を考える必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
SMAP1については、WPBの分解を抑制している可能性が高く、そのメカニズムを調べたい。WPBとWPBに輸送されていないvWFは両方ともリソソーム内に存在することが報告されている(Torisu et al. Nat Med, 19, 1281-1287,2013)。SMAP1がどちらに関与するかは不明だが、長いWPBの分解を抑制することから、WPBの分解ではないかと考えられる。分泌顆粒の分解にはオートファジーが関与すると考えられており、SMAP1はオートファジーを抑制する分子として機能する可能性がある。この仮説を調べるため、オートファジー抑制によってSMAP1KD細胞の表現型が回復するかどうか、またSMAP1に結合する分子を同定し、SMAP1の機能の全容を解明したい。
AGFG2については、GAPドメインのほか、FGリピートという配列がGAPドメインのC末端側に連なっている。GAPドメインとFGリピートの重要性を調べるため、それぞれのドメインを削った変異体を作成し、HUVECに過剰発現させ、どのドメインがvWF分泌に大事かどうか調べる。またAGFG2は唾液腺で発現が高いことが報告されている(FAGERBERG et al, Mol Cell Proteomics, 13, 397-406,2014)。他の分泌細胞でも重要である可能性が高いことから、ムチン分泌をするゴブレット細胞、インスリンを分泌する膵島β細胞など、他の分泌細胞における分泌にも重要であるかどうかを調べる。
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[Journal Article] Arf GTPase-Activating proteins SMAP1 and AGFG2 regulate the size of Weibel-Palade bodies and exocytosis of von Willebrand factor2021
Author(s)
Asano Watanabe, Hikari Hataida, Naoya Inoue, Kosuke Kamon, Keigo Baba, Kuniaki Sasaki, Rika Kimura, Honoka Sasaki, Yuka Eura, Wei-Fen Ni, Yuji Shibasaki, Satoshi Waguri, Koichi Kokame, Yoko Shiba
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Journal Title
bioRxiv
Volume: -
Pages: -
DOI
Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Identification of ArfGAPs involved in formation of Weibel-Palade Bodies2020
Author(s)
Kosuke Kamon, Keigo Baba, Asano Watanabe , Hikari Hataida , Naoya Inoue, Rika Kimura, Honoka Sasaki, Kuniaki Sasaki, Yuka Higuchi, Koichi Kokame, Yoko Shiba
Organizer
第93回日本生化学会大会
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