2020 Fiscal Year Research-status Report
一分子分光による相分離した液滴中タンパク質の構造揺らぎ追跡
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19K06577
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小井川 浩之 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (40536778)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 液-液相分離 / タンパク質 / 一分子蛍光測定 / FRET / LAF1-RGGドメイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度までに、LAF1-RGGドメインの発現精製と二重蛍光標識に成功し、測定用の試料を得た。この試料に対して独自装置を用いて高時間分解能一分子FRET測定を行い、LAF1-RGGドメインは希薄な溶液中においても収縮した状態を保持していることを示唆する結果を得た。さらに、液滴中での一分子FRET測定を行うための装置を開発した。
2020年度は、LAF1-RGGドメインの変異体の作製と二重蛍光標識に取り組んだ。LAF1-RGGのアミノ酸配列は、カチオン-π相互作用に重要なチロシンが多く含む。また、疎水性アミノ酸を多く含む領域も存在している。そこで、全チロシンをセリンに置換したYtoS変異体と疎水性の高い部分を欠失させた変異体の二種類を作製、二重蛍光標識した。顕微鏡観察によってYtoS変異体では液滴形成が見られず、疎水性領域欠失変異体では液滴形成能が低いことが確かめられた。一方、希薄溶液の一分子FRET測定を行うと、比較的収縮した状態であることがわかった。これらの結果は、分子が収縮しやすい性質だけでは、液滴形成に十分ではないことがわかる。おそらく液滴形成に重要だと考えられる分子間の相互作用において、カチオン-π相互作用と部分的な疎水相互作用が主要な役割を担うのではないかと考えている。以上のように2020年度までに、液液相分離の分子機構の理解に重要な示唆を与えてくれる成果が得られた。
また、液滴内での分子の状態を調べるために、新開発の装置を使って液滴中での一分子FRET測定にも取り組み、予備的な結果も得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度で行うことを予定していた、LAF1-RGG変異体の発現、精製、二重蛍光ラベル化を行い、希薄溶液中での一分子FRET測定を行うことができ、ほぼ計画通りに進んだ。
液滴中での一分子FRET測定については、新開発の測定装置をテストし、十分な性能を持つことは確認できた。計画通りに測定も進めている。
以上の理由から、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
LAF1-RGGドメインの希薄溶液一分子FRET測定については、ほぼ計画していた測定が完了したため、2021年度中に成果を論文としてまとめる予定である。
今後は液滴中での一分子FRET測定に集中して取り組んでいく予定である。
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| Causes of Carryover |
2020年度は新型コロナウイルス流行により旅行が困難になり、旅費を使わなかったため、次年度使用額が生じた。
2021年度は主に装置の改良費用や、タンパク質精製に必要な消耗品購入費用、論文発表に必要な経費などに使用する予定である。
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Research Products
(3 results)
