2020 Fiscal Year Research-status Report
原子間力顕微鏡と化学発光タンパク質を用いたATP超解像イメージング法の開発
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19K06580
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
市川 壮彦 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任助教 (10462201)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 原子間力顕微鏡 / 超解像顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
原子間力顕微鏡（AFM）を用いたATP超解像顕微鏡作製のために、前年度で開発したカンチレバー探針へのタンパク質結合方法を用いて同じく前年度精製したNano-Lantern (ATP1)を結合し、ATP添加による輝度上昇を観察しようとした。探針先端部へのタンパク質の結合を確認することができたものの、ATP添加によるシグナルはほとんど確認することができなかった。様々な原因を想定し、精製のやり直し、別の吸着方法での観察、測定機器・条件の変更等を行ったがあまり改善せず、結局発光によるプローブは多点観察を必要とするプローブ顕微鏡には不向きでないかと考え、蛍光輝度の変化でATPを検出するMaLion G (S. Arai et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2018)に変更することに決定した。所有者に連絡を取り精製MaLion Gを入手、現在その評価を行っている最中である。共焦点・AFM融合顕微鏡作製に関しては前年度に引き続いて作業を続け、必要な部品の調達・組み立てを行い組み立てに関しては完了した。さらに加工したプレートヒーターとコントローラーを用いて温度制御システムを構築し、サンプル付近で温度を37℃に保つことができるようになった。今後は各機器を統合的に制御するシステムを構築し実際に稼働するかどうか試す。もし動作するようになればGFPを結合した探針を用いてAFMと蛍光の同時測定を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の目標である、（１）共焦点・AFM融合顕微鏡構築、（２）Nano-Lantern (ATP1)の精製、（３）探針先端へのタンパク質の結合方法開発、（４）ミトコンドリアの単離のうち（２），（３），（４）を初年度で達成し、（１）に関しても進展が見られたが、プローブの評価に手間取っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
共焦点・AFM融合顕微鏡を完成させテスト像を得る。MaLion Gを用いたATP添加による輝度上昇時間を測定し、プローブが使用可能であればAFMとATPイメージングの同時測定を行う。測定対象として、初めはATP勾配が形成されているデバイスを作製しそれを用いて検討を行う。次に精製したミトコンドリアをマイカ上に固定しミトコンドリア表面のAFM像とATP微小局在分測定を試みる。
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