2019 Fiscal Year Research-status Report
Dynamics analysis of virus entry and budding by high speed AFM
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19K06583
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
臼倉 英治 名古屋大学, 未来材料・システム研究所, 研究員 (00643727)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 高速走査型原子間力顕微鏡 / インフルエンザウイルス / エンドサイトーシス / １分子観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、インフルエンザウイルス（以下IAV）の細胞へのエントリーから増殖、出芽に至る過程をイメージングにより解明する研究である。イメージングには、クライオ電子顕微鏡や免疫フリーズエッチングレプリカ法、原子間力顕微鏡(以下AFM)などの最新技術を用いて、超高分解能構造解析とともに、vRNA+NP、M1タンパク質など主要ウイルスタンパク質（マーカー）の細胞内動態から、IAVの細胞へのエントリーから脱出までを形態的に明らかにすることを目指している。初年度は、ウイルスが細胞へエントリーする様子、あるいは細胞から出芽する様子をAFMでリアルタイムに観察するシステムの構築を行った。エントリーを観察するシステムでは、スライドガラス上に細胞を培養した後、そのスライドガラスに細いチューブと小さなノズル状のキャップを装着した物を細胞溶液に接触させる。そして、AFMで細胞表面の観察を開始してからチューブを通して蛍光修飾を施したIAVを含んだ溶液を加える。すると、チューブを通してノズルからIAVがばら撒かれ細胞の表面に到着する。さらに、同時に共焦点型蛍光顕微鏡を用いてウイルスに結合したGFPの蛍光を追跡することで、細胞表面上でどれがIAVかを判別できるように工夫を行った。その結果、IAVが細胞表面で起きるエンドサイトーシスを利用して細胞へエントリーする様子を観察することが可能になった。一方で、宿主細胞からIAVが出芽する様子をAFMで観察するシステムの構築も行った。培養した細胞にIAVをばら撒き十分にインキュベーションした後、AFMで細胞表面の観察を行うと細胞表面に空いた穴からウイルスらしき形状の物体が出てくる様子が多くみることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の目的であるインフルエンザウイルスが細胞へエントリーする様子あるいは出芽する様子をAFMと蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで相関観察するシステムの構築をすることができた。これにより、宿主細胞へのエントリーにか掛かる時間やキネティクスの分析が可能になった。さらに、タンパク質への蛍光染色を用いることで宿主細胞側のどのようなタンパク質が関わっているかも検証できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、インフルエンザの細胞へのエントリーあるいは細胞からの出芽の際に関連しているタンパク質の同定を目指している。関連していると疑われるタンパク質の阻害剤を用いることで細胞表面で起きるエントリーや出芽のキネティクスにどう影響が出るかを生化学的手法やAFMだけではなく電子顕微鏡も用いて明らかにしていきたい。これが明らかになることで、細胞内におけるウイルスの動きについて新たなモデルが得られると考えている。
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| Causes of Carryover |
AFM用のカンチレバーを中心に機器周りの消耗品の希少性が高く値段が高いため、何か不備があった場合に備えて全額消費を抑えていた。また、学会への参加も考えていたがcovid-19の影響で予定されていた学会や研究会が中止になったことも次年度使用額が生じた理由につながる。次年度も引き続きカンチレバーや試薬などの消耗品の購入、学会などへの旅費、論文投稿に使用する予定である。
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