2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K06584
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
関山 直孝 京都大学, 理学研究科, 助教 (50758810)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 相分離 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は、核磁気共鳴法を用いてTIA-1のプリオン様ドメインの構造および運動性を反映する緩和速度の解析を行い、ALS変異が周辺領域の緩和速度に影響を与えることを明らかにした。本年度は、この緩和速度をTIA-1のアミノ酸配列から予測する手法を確立した。TIA-1には、芳香族、極性、そして疎水性アミノ酸が豊富に含まれている。我々は、これらアミノ酸の種類と緩和速度に相関があるのではないかと考え、アミノ酸の物理化学的性質を数値化したアミノ酸指標値を用いて緩和速度を予測するモデルの構築に成功した。さらに、緩和速度と相関の高いアミノ酸の物理化学的性質には、疎水性度やベータシート形成傾向が含まれていたことも明らかにした。以上の解析は、TIA-1の振る舞いはアミノ酸残基の物理化学的な性質が協調することで生み出されることを強く示唆している。
次に、ALS変異体と野生型との結晶構造解析に成功した。昨年度に行った分子動力学計算から、ALS変異は分子間の相互作用様式に影響を与えている可能性が示唆された。この相互作用変化を構造学的に明らかにするため、野生型の配列を持つ短鎖ペプチドと、ALS変異を含む短鎖ペプチドの結晶化を試みたところ、微小な針状結晶を得た。さらに、電子線回折による回折データの収集とその解析を行ったところ、それぞれの分子モデル構築が可能となった。両者の結晶構造を比較すると、野生型とALS変異型の基本構造はほぼ一致していたが、アセンブリ様式は全く異なっていた。野生型は大部分が溶媒に露出している溶媒和優先型であるのに対し、ALS変異型は側鎖間の相互作用を形成するタンパク質間相互作用優先型の積層構造を形成していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、液-液相分離を起こすTIA-1の相互作用様式や立体構造を解明することを第一の目的としている。現在までに、TIA-1のプリオン様ドメインが引き起こす液-液相分離の過程を核磁気共鳴法（NMR）により解析することで、相互作用に重要な領域の同定に成功した。さらに、緩和速度をアミノ酸配列から予測する手法も確立した。次に、相互作用に関与している最小領域を用いて結晶化を行い、電子線回折による結晶構造解析にも成功し、原子レベルの相互作用様式も明らかになったことからも、第一の研究については順調に進行していると考えている。今後は、液滴形成後に出現するアミロイド線維の立体構造を明らかにするため、クライオ電子顕微鏡を用いた解析を行う。
第二に、本研究では液滴内に取り込まれたタンパク質の構造状態を解析することを目的としている。本年度は、細胞内で形成されるTIA-1顆粒に取り込まれるタンパク質を網羅的に同定するため、細胞内TIA-1顆粒の単離に着手した。我々はテトラサイクリン誘導系システムを用いて、GFP融合型TIA-1の発現誘導可能な細胞株を作成した。次に、この細胞を亜ヒ酸に曝露しストレス顆粒形成を誘導した。そして、細胞抽出物を低速・高速で遠心することでサイズ依存的な凝集体の分離を行い、TIA-1顆粒の単離に成功した。今後はTIA-1顆粒の質量分析法による解析を行い、顆粒に取り込まれたタンパク質の同定を行う予定である。第二の研究については当初考えていた手法と異なるが、得られる結果については同等かそれ以上であると考えているので、ある程度順調に進行していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、第一にTIA-1が形成するアミロイド線維の構造解析を行う。これまでもクライオ電子顕微鏡によるアミロイド線維の構造解析を行なっていたが、サンプルの不均一性により成功していなかった。そこで本年度は、サンプルのアミノ酸配列や精製方法、線維形成の溶液条件などを最適化したところ、線維構造の均一性が上がり解像度も上昇した。来年度はこのアミロイド線維サンプルを用いて、クライオ電子顕微鏡による構造解析を達成する。
第二に、細胞内に形成されたTIA-1顆粒の質量分析法による解析を行い、顆粒に取り込まれたタンパク質の同定を行う。TIA-1顆粒の調製方法は前述の通りであるが、ストレスに曝露していないコントロールサンプルの作成に検討の余地があるため、来年度は細胞の培養条件などの最適化を行う予定である。
第三に、液-液相分離やアミロイド線維化を引き起こす人工タンパク質を創出する。本年度は、アミノ酸の指標値から緩和速度を予測するモデルの構築に成功したが、さらに本手法を応用することでTIA-1のアミノ酸配列から温度可逆的な液滴を形成する人工のリコンビナントタンパク質を調製することに成功した。これは、本手法によりアミノ酸配列から自己組織化する天然変性タンパク質を創出することが可能であることを示している。そこで、自己組織化するタンパク質群のアミノ酸配列から液-液相分離やアミロイド線維化を引き起こす共通原理を探索し、それを応用することで様々な溶液環境に応答して自己組織化する人工タンパク質を設計することにも着手する。
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