2019 Fiscal Year Research-status Report
Structural analysis of membrane-bound proteins using synchrotron-radiation circular-dichroism and linear-dichroism spectroscopy
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19K06587
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
松尾 光一 広島大学, 放射光科学研究センター, 准教授 (40403620)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 放射光円二色性 / 真空紫外線 / 生体膜相互作用 / 分子動力学 / 二次構造 / 天然変性蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真空紫外円二色性（VUVCD）法による蛋白質の二次構造解析法（含量・本数・配列）を、生体膜存在下のα1酸性糖蛋白質(AGP)とミエリン塩基性タンパク質(MBP)の構造研究に適用し、各蛋白質の膜結合構造及び膜結合部位を明確にした。
AGPは、細胞膜内への薬物輸送に関わる蛋白質とされており、本研究では、5種類のリン脂質分子で作成された直径100nmのリポソーム膜と相互作用したAGPの構造をVUVCDにより解析した。その結果、リン脂質分子の正味電荷が負であるリポソームと相互作用したAGPは、7本のαヘリックス構造を形成し、N端とC端のヘリックス領域が膜結合部位であることが示唆された。塩添加実験から、N端のヘリックスが崩壊したため、C端のヘリックスは両親媒性ヘリックスであり、疎水性相互作用と静電的相互作用で膜と結合し、N端のヘリックスは静電的相互作用のみで膜と結合していることがわかった。
MBPは、ミエリン鞘という生体膜と結合する膜結合タンパク質であり、その膜結合構造が、ミエリン鞘の形成に大きな役割を担う。本研究では、生体膜存在下でのMBPの構造を明らかにし、MBPによるミエリン膜の安定化メカニズムについて考察した。生体膜は、ホスファチジルイノシトールのリン脂質分子から作成したリポソームを用いた。リポソーム存在下のMBPの二次構造含量をVUVCD法により解析し結果、MBPはヘリックス構造（含量：40％、本数：8本）を形成することが分かった。VUVCD-NNや分子動力学的解析により、各へリックス領域の膜との親和性を解析した結果、MBPには、両親媒性ヘリックス（疎水性相互作用と静電的相互作用が関与）と非両親媒性ヘリックス（静電的相互作用が関与）がそれぞれ3本存在することが分かり、MBPの6つのヘリックス領域が生体膜と強く結合し、ミエリン膜の構造安定化に寄与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
以下の利用により、当初の計画以上に進展していると評価した。
①本年度は、α1酸性糖蛋白質(AGP)とミエリン塩基性タンパク質(MBP)を対象にし、VUVCD分光法による膜結合蛋白質の構造解析を行った。そのため、目的とした2種類の蛋白質の二次構造含量・本数・配列に関する研究はすでに終了し、論文に採択、また投稿中である。このため現在、他の膜結合蛋白質に対してもVUVCDによる構造解析を実施しているため。
②直線二色性による膜結合蛋白質の二次構造の配向解析では、予備的に実験として実験光源を用いた測定をすでにペプチドに対しい実施しており、膜表面に対するペプチド二次構造の配向の検出に成功しているため。また、このペプチドの膜結合構造形成中の準膜結合構造の解析も進んでいるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降の研究方針を以下に示す。
１．放射光円二色性装置に、直線二色性が測定できる装置を構築し、真空紫外領域の直線二色性の計測を可能にする。短波長領域の測定により、高エネルギー遷移に基づいた膜蛋白質の配向構造解析法を構築し、MBPとAGPの構造解析に応用する。また、他の膜結合蛋白質や膜内で多量体を形成するペプチドの配向構造の解析も実施し、直線二色性法の有効性を高める。
２．VUVCD-NN法は、水溶性蛋白質のアミノ酸配列と二次構造情報をデータベースに使用している。膜蛋白質のアミノ酸配列と二次構情報をこのデータベースに組み込むことで、膜蛋白質に特化した二次構造解析法を構築し、AGPとMBPの膜結合構造をさらに精密化させる。
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| Causes of Carryover |
昨年度予定していた国内学会が中止となったため、また論文の投稿が遅れたたため、差額が生じた。令和2年度補助金と合わせて、国内外の学会旅費、論文投稿費、消耗品（光学結晶、生体試料など）に利用する予定である。
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[Journal Article] Study on irradiation effect of mid-infrared free electron laser on hen egg-white lysozyme by using terahertz-time domain spectroscopy and synchrotron radiation vacuum-ultraviolet circular-dichroism spectroscopy2019
Author(s)
T. Kawasaki, Y. Izumi, G. Ohori, H. Kitahara, T. Furuya, K. Yamamoto, K. Matsuo, M. Tani, K. Tsukiyama
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Journal Title
Journal of Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves
Volume: 40
Pages: 998-1009
DOI
Peer Reviewed
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