2019 Fiscal Year Research-status Report
骨形成に関与する核内受容体の脂溶性シグナル伝達分子認識機構の解明
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19K06588
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
杉山 成 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 教授 (90615428)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 脂溶性ビタミンK / 凝固ゲル中結晶化 / タンパク質 / Ｘ線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ステロイドX受容体（SXR）は骨粗鬆症治療薬の標的タンパク質である。脂溶性ビタミンK2と結合することで活性化され、骨形成に関与する遺伝子発現を誘導する転写因子である。これまでの研究から、各種脂溶性ビタミンKの側鎖部分において、SXRに対する結合活性の強さに明確な差があることが分かっている。本研究では、各種脂溶性ビタミンK－SXRの複合体構造とSXRに対する結合能および転写活性の強さをそれぞれ比較することによって、SXRの分子認識機構の構造基盤を明らかにすることを目的とする。
本年度は，大腸菌を用いたSXRの大量発現と精製を行い解析に必要なサンプル調整を進めた。具体的には，Hisタグを付加したfusionタンパク質として大腸菌にて大量発現させ，Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーによる粗精製後にSuperdexを用いてゲル濾過クロマトグラフィーによって精製サンプルを取得した。この精製サンプルを用いて従来法によるアポ型SXR結晶化実験をおこなったところ，再現性ある良質な結晶を得ることに成功した。この結晶を用いてSPring-8シンクロトロン放射光によるX線回折実験を行い2.5A分解能の回折強度データを取得した。現在，この回折強度データを用いて構造解析を進めている。さらに、凝固ゲル中結晶化法を用いてアポ型SXR結晶化実験を進めたところ，微結晶ではあるものの凝固ゲル中で育成させることに成功した。従来法とほぼ同じ結晶化条件でゲル中結晶が得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画は，楮解析向けて①SXRサンプルを大腸菌にて大量発現・大量精製によって調整すること，また②SXRアポ型結晶を取得することである。①については，Hisタグを付加したfusionタンパク質として大量発現させ，Ni-NTAによる粗精製後にSuperdex200 increase 10/300を用いてゲル濾過カラムによって精製サンプルを取得した。②については結晶化条件を決定した。さらに、凝固ゲル中結晶化法を用いてアポ型SXR結晶をゲル中で育成させることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度以降は，ゲル中SXR結晶は微小結晶であるため結晶化条件の最適化を進めると共に、微小結晶でも回折測定可能な高強度ビームをもつ放射光ビームラインを選定して回折データを取得し構造解析を行う。さらにゲル中で育成したアポ型SXR結晶を用いて浸漬法により各種脂溶性ビタミンとの複合体結晶を作製し構造解析を進めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ禍の影響により，研究実験ができない状況が発生したため。目的サンプルの精製実験，結晶化および回折強度データ収集実験，構造解析に使用する計画である。
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