2019 Fiscal Year Research-status Report
偏光FRET法による細胞内アクチンのGF変換イメージング
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19K06593
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
須河 光弘 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (80626383)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢島 潤一郎 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (00453499)
道上 達男 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (10282724)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アクチン / FRET / 偏光 / ライブセルイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年のアクチンの構造解析からアクチンが重合する際に分子構造がねじれること、さらにアクチン結合タンパクとの複合体の構造解析からアクチンの分子構造のねじれがアクチン結合タンパクごとに異なることが示唆された。一方で、アクチン結合タンパクの１つであるコフィリンが結合したアクチンフィラメントではコフィリンへの親和性が上昇することが知られている。このようなアクチンの構造多形性やアクチン結合タンパクの協同的結合が、細胞内でも起きている現象なのか、また細胞内機能にどのような効果があるのかなど構造機能相関について、まだよく分かっていない。この研究課題を解決するには、細胞内の直径５nm程度のタンパク質の構造変化を１分子レベルで捉えられるライブセルイメージング法の開発が必要であった。そこで、偏光を利用した蛍光共鳴エネルギー移動（偏光FRET）法を着想し、開発を進めている。偏光FRET法に必要となる２種類の蛍光色素Cy3-bis-maleimideとCy5-bis-maleimideは完成し、これをアクチンのシステイン変異体に部位特異的に修飾し、ライブセル偏光FRETイメージングを行うことまで成功した。研究は概ね順調であるが、pFRET-アクチンの改良や実験条件の最適化などを進めていく必要がある。また共同研究にて、偏光FRET法を回転分子モーターであるF1-ATPaseに応用して、従来の計測法では捉えることができなかったF1-ATPaseの回転運動中の構造変化を捉えることを目指して研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
偏光FRET法では、蛍光を部位特異的に修飾して偏光させる必要がある。そこで、２つのシステイン反応性の官能基を持つ蛍光色素（Cy3-bis-maleimideとCy5-bis-maleimide）を用いる。この場合、１つの蛍光を修飾部位につき２つのシステイン変異を導入する必要があるので、計４箇所のシステイン変異を導入することになる。Protein Data Bankに登録されたいくつかのアクチンの立体構造を比較することで、４箇所のシステイン変異部位を決定した。精製したアクチンのシステイン変異体にCy3-bis-maleimideとCy5-bis-maleimideを修飾し、pFRET-アクチンを得た。蛍光修飾時に軽度のアグリゲーションが見られたが、遠心処理でアグリゲーションを除去し、回収したpFRET-アクチンに重合能があることを確認した。重合能を確認できたので、このpFRET-アクチンを用いてin vitroでの1分子FRETイメージングを行なった。pFRET-アクチンのFRET効率の分布に３つ程度の分集合が存在することが示唆された。
次にpFRET-アクチンをHeLa細胞内導入し、ライブセル蛍光イメージングを行なった。HeLa細胞内にpFRET-アクチンを導入する方法として、細胞透過性ペプチドを利用した方法とエレクトロポレーションの２つの方法を試験した。エレクトロポレーション法では、生細胞の細胞質に導入されたpFRET-アクチンが確認でき、良好な結果が得られた。全反射顕微鏡にて蛍光イメージングを行ったところ、HeLa細胞の辺縁部にpFRET-アクチンが局在し、アクチンネットワークの密度が高い領域が形成されているのが観察された。
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| Strategy for Future Research Activity |
pFRET-アクチンを作成し、これをエレクトロポレーション法でHeLa細胞内に導入し、ライブセルFRETイメージングを行うまでの一連の実験系を確立することができた。しかし、pFRET-アクチンの改良や、エレクトロポレーションの条件など実験条件をさらに検討する必要がある。また、共同研究にて偏光FRET法をF1-ATPaseに応用し、従来の計測法では捉えることができなかったF1-ATPaseの回転運動中の構造変化を捉えることを目指し、研究を進めている。
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| Causes of Carryover |
2019年度内に出版予定であった論文の出版が次年度に伸び、2020年度に必要となる掲載費を確保しておくために、次年度使用額が生じた。
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Research Products
(10 results)
