2020 Fiscal Year Research-status Report
偏光FRET法による細胞内アクチンのGF変換イメージング
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19K06593
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
須河 光弘 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (80626383)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢島 潤一郎 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (00453499)
道上 達男 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (10282724)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アクチン / 蛍光イメージング / 偏光 / 構造変化 / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内の直径５nm程度のタンパク質の構造変化を１分子レベルで捉えられるライブセルイメージング法の開発を目指し、改良型FRET（偏光FRET）法を着想し、開発を進めている。本研究ではアクチンをモデル分子として、細胞内におけるアクチンの構造機能相関の解析を進めている。近年の研究によりアクチンは重合・脱重合に伴って構造変化をすること、またコフィリンやミオシンなど一部のアクチン結合タンパクはアクチンフィラメントに対して協同的に結合すること、さらにアクチン結合タンパクとの複合体においてアクチンの分子構造のねじれの程度がアクチン結合タンパクごとに異なることが分かってきた。しかし、このようなアクチンの構造機能相関が細胞内の現象に対してどのような効果があるのかはまだよく分かっていない。これまでに偏光FRET法に必要な蛍光色素を完成させ、これらをアクチンに部位特異的に修飾して蛍光修飾アクチン（pFRET-アクチン）を作成した。pFRET-アクチンを細胞内に導入してライブセル蛍光イメージングを行うところまで成功している。しかし、in vitroでの１分子計測からアクチンに修飾した蛍光の偏光が安定していない可能性があることが示唆された。また、ライブセルイメージングにおいて単分子レベルでのアクチン重合過程の観察に成功していない。そこで、pFRET-アクチンの作成法の改良およびセルイメージングの条件の最適化などを進めて研究を進展させる必要がある。共同研究で進めている偏光FRET法を用いたF1-ATPaseの構造変化計測も引き続き進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
アクチン結合タンパクの１つであるチモシンのアクチン結合ドメインを融合させたpFRET-アクチンを用いてin vitroでの1分子FRETイメージングを行ったところ、一部の分子は２状態遷移を示した。このFRET効率の変化は、チモシンのアクチン結合ドメインの結合解離に伴うアクチンの構造変化に由来すると考えられる。しかし、FRET効率が変化する分子の割合やFRET効率の分布から考えると、アクチンに修飾した蛍光色素の偏光が安定していない可能性もある。一方、pFRET-アクチンをHeLa細胞内に導入し、ライブセル蛍光イメージングを行ったところ、アクチンフィラメントに組み込まれたpFRET-アクチンからのFRETを観察することに成功している。しかし、単分子レベルでの重合過程を観察することはまだ成功していない。さらなるpFRET-アクチンの作成条件の改良とライブセルイメージングの条件検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
pFRET-アクチンの作成からライブセルFRETイメージングを行うまでの一連の実験系はすでに確立している。あとはpFRET-アクチンの作成法と細胞内導入の条件検討が進めば、研究が進展すると期待している。また、共同研究で進めている偏光FRET法を用いたF1-ATPaseの構造変化計測を引き続き進めていく。
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| Causes of Carryover |
予定していた海外出張が取り止めになったために次年度使用額が生じた。今年度に開催予定の海外学会への旅費として使用する予定である。
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