2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K06596
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
紺野 宏記 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 准教授 (80419267)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 高速原子間力顕微鏡 / 細胞内外小胞 / 酸化ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らは、抗酸化酵素ペルオキシレドキン（Prx）が負電荷を有するリン脂質およびヌクレオチドと会合して直径30~80 nmの小胞（以後、Prx-MVと記す）を形成することを最近発見した(Haruyama et al., J. Mol. Biol. 2018)。本研究課題では、これまでに全く知られていなかったこの意外な発見を土台に、Prx-MVが最近注目されているエクソソームを含む細胞内外小胞の一形態であることを提案し、その形成メカニズム、細胞内（外）における動態および生理学的機能を明らかにする。そのため、はじめに脂質やヌクレオチドとの相互作用に重要なPrx上のアミノ酸残基の同定を行った。つぎに、細胞内(外)小胞におけるPrxの局在を解明するため、蛍光タンパク質と融合させたPrx, 初期エンドソームマーカータンパク質、後期エンドソームマーカータンパク質をそれぞれ発現する細胞株を樹立し、それらの細胞内におけるPrx, 初期エンドソーム、後期エンドソームの酸化ストレス依存的な局在の関連性を調べた。さらに、脂質、ヌクレオチド依存的に形成されるPrx高分子複合体の構造ダイナミクスを高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)により観察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Prxと脂質との相互作用のリアルタイム観察をHS-AFMを用いて行った。基板に平面状に展開した脂質二重層にPrxが結合しないことはすでに明らかにしている。そこで、基板をカーボンコートすることで脂質リポソームが基板上で展開できないようにして、脂質リポソームとPrxの相互作用過程をAFM観察した。その結果、Prxの脂質との相互作用は、脂質リポソームの粒子径に強く依存することがわかった。脂質やヌクレオチドとの相互作用に重要なPrx上のアミノ酸残基の同定については、Prx上のリジン、アルギニンの内の7個に部位特異的アミノ酸置換を導入すると、Prxは脂質と相互作用できないことを明らかにした。さらに解析を進めると、この7個のリジン、アルギニンすべてが、Prxと脂質との結合に関与していることがわかった。次に、Prx上にあるヌクレオチド結合部位を同定するため、UV光照射により近接しているアミノ酸に強固に結合する性質を持つフェニルアジド基を付加したヌクレオチドを使用して、Prxとヌクレオチドを分子間架橋させることに成功した。ヌクレオチドがPrx上のどのアミノ酸と架橋しているかを質量分析法りより調べている(現在、質量分析結果を解析中である)。細胞内(外)小胞におけるPrxの局在解明を解明するため、蛍光タンパク質と融合させたPrx、初期エンドソームマーカータンパク質、後期エンドソームマーカータンパク質を発現する細胞株の樹立を行った。興味深いことに、脂質結合能を欠失させたPrx変異体を導入した細胞株では、酸化ストレス依存的な初期および後期エンドソームの局在変化がPrx野生株のそれと大きく異なることがわかった。この事実は、細胞内におけるPrxと脂質との相互作用が、エンドソームの局在に深く関わっている可能性を示唆している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、初期エンドソームや後期エンドソームなどの細胞内小胞に対するPrxの局在だけでなく、細胞外小胞であるエクソソームにおけるPrxの局在も明らかにする。Prxは多種の細胞由来のエクソソームに含まれていることが報告されているが、高速原子間力顕微鏡観察で発見された高分子複合体のように、Prxがエクソソームの表面全体を覆うように局在しているかは明らかではない。今後は、エクソソームを市販の回収キットにより回収し、プロテアーゼ K 処理によりエクソソーム膜上に存在するタンパク質を限定分解させる。プロテアーゼK未処理のエクソソームとの比較をウェスタンブロット法で行い、エクソソームの膜・内部画分におけるPrx量を解析する。これらの解析を初期エンドソームと後期エンドソームにも適用し、Prxが初期エンドソーム、後期エンドソーム、エクソソームの表面に常に存在するのか、それとも特定の段階においてベジクルに取り込まれるのかを明らかにする。さらに、AFM観察中にヌクレオチドを加え、どのような過程を経てPrx、脂質、ヌクレオチドが含まれた高分子複合体が形成されるかを、高速AFMを用いた詳細な表面構造観察により明らかにする。
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