2019 Fiscal Year Research-status Report
CLEM study for the molecular dynamics of the cultured synapse model of neuromuscular junction
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19K06600
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
宮澤 淳夫 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60247252)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 神経筋接合部 / アセチルコリン受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）の足場タンパク質であるrapsynの遺伝子にGFP遺伝子を融合し、それを定常的に発現するC2C12細胞を作製した。このC2C2細胞を筋管細胞に分化誘導してnAChR、rapsyn、筋特異的受容体チロシンキナーゼ（MuSK）を含む分子クラスターを形成させ、神経筋接合部（NMJ）のポストシナプスモデルとした。分子クラスターの形成初期と崩壊が始まった段階で、nAChRとMuSKを蛍光標識し、光学顕微鏡を用いて、nAChR、rapsyn、MuSKの詳細な局在解析を行った。その結果、分子クラスターの形成初期とクラスターの崩壊が始まった段階で、分子クラスター内におけるそれぞれの分布が異なっている可能性が示された。
また、マウスES細胞から分化誘導した運動神経と筋管細胞を共培養してNMJモデルを作製するために、ES細胞から筋管細胞へ分化誘導し、長期培養する条件検討を行った。その結果、コラーゲンゲル上でES細胞がら作製した胚様体をシート状に培養し、筋管細胞へ分化させるために必用なポリアミンの濃度を最適化することによって、筋管細胞への分化効率を上げることができた。そこで、筋繊維への種々の分化マーカーを用いて細胞を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、筋管細胞への分化状態は一様ではなく、ディッシュのウェルごとに異なったが、最も分化が進んだウェルでは、サルコメアの形成を確認することができた。この筋管細胞と、ES細胞から分化誘導した運動神経を共培養することによって、運動神経軸索を筋管細胞に向かって伸長させることができた。また、これらの細胞について、プレシナプスマーカーとポストシナプスマーカーを用いて蛍光標識したところ、運動神経軸索と筋管の接合部分で、NMJが形成されたことを示唆する、ポストシナプスマーカーとプレシナプスマーカーの共局在が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、(1)NMJの培養シナプスモデルの作製、(2)光学顕微鏡およびクライオ電子顕微鏡によるNMJの相関観察法の確立、(3)NMJの構造と機能に関わる分子メカニズムの解明という3つの目標を掲げている。3年間の研究期間の初年度に、「(1)NMJの培養シナプスモデルの作製」をほぼ達成できたこと、また、「(2)光学顕微鏡およびクライオ電子顕微鏡によるNMJの相関観察法の確立」において、光学顕微鏡を用いた経時的な分子の観察法が確立していることから、おおむね予定通りに進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
NMJの形成効率を上げるために、ES細胞から分化誘導した筋管細胞と運動神経の共培養のタイミングや培養期間について検討を行う。 また、形成された運動神経と筋管細胞の接合部分を蛍光標識して光学顕微鏡で観察した後、その位置を電子顕微鏡で同定して微細構造を観察（相関観察）し、成熟したNMJに特徴的な構造が見られるか確認する。
さらに、GFP融合rapsynを定常的に発現するC2C12細胞由来筋管細胞表面のnAChRおよびMuSKを金コロイド粒子標識して分子クラスターを形成させながら、raspynに融合して発現させたGFPを利用して光学顕微鏡でタイムラプス観察を行い、個々の分子クラスターの形成状態を判断した上で、細胞を固定し、それぞれの分子クラスターの位置を電子顕微鏡で同定（相関観察）して、クラスター部位におけるnAChR、MuSKの分子局在や分布を調べる。Rapsynの分子局在については、申請者らが開発した電子顕微鏡で観察可能な遺伝的コード化標識を施したrapsynを定常的に発現するC2C12細胞を作製して、細胞表面のnAChRを蛍光標識した上で、分子クラスターを形成させ、光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて相関観察を行う。
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