2021 Fiscal Year Annual Research Report
CLEM study for the molecular dynamics of the cultured synapse model of neuromuscular junction
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19K06600
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
宮澤 淳夫 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (60247252)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 神経筋接合部 / アセチルコリン受容体 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)の足場タンパク質で、常にnAChRと共局在することが明らかにされているrapsynにGFPを融合させたrapsyn-GFPを定常的に発現するC2C12細胞を筋管へ分化させたものを培養プレシナプスモデルとして用いた。この細胞表面に局在しているnAChRと筋特異的受容体チロシンキナーゼ(MuSK)を、大きさの異なる金コロイド粒子で標識し、蛍光タイムラプス観察を行った。Agrinは、本来、プレシナプスから放出される糖タンパク質で、MuSKを介したシグナル伝達機構により、nAChRのクラスター化を促進する因子である。蛍光タイムラプス観察により、形成途中または崩壊途中にあるクラスターを同定し、そのクラスターを含む超薄切片を作製した。超薄切片を透過型電子顕微鏡で観察したところ、クラスター近傍の細胞質中の一部の小胞で、nAChRまたはMuSKの局在を示す金コロイド粒子が観察された。崩壊中のクラスター近傍では、nAChRとMuSKの両方を含むラメラ状の小胞が多数観察されたのに対して、形成中では、ほとんどが単層の小胞であった。また、形成中でのみ、nAChRを含まず、MuSKのみを含む小胞が観察された。nAChRのクラスター形成時には、MuSKおよびnAChRが細胞内へ取り込まれることが生化学的な研究から明らかにされていたが、光学顕微鏡観察と電子顕微鏡観察をシームレスに連携させた本研究課題により、初めて、電子顕微鏡レベルで細胞内に取り込まれたnAChRとMuSKの分子局在を捉えることができた。
また、rapsynのような細胞内に局在するタンパク質については、遺伝的コード化標識法を用いることにより、免疫標識を行うことなく、電子顕微鏡で検出できる可能性を、本研究課題により示すことができた。
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Research Products
(1 results)
