2020 Fiscal Year Research-status Report
In vivo単一細胞解析から明らかにする染色体機能ドメインの可塑性とその意義
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19K06610
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
竹林 慎一郎 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (50392022)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 染色体ドメイン / シングルセル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，最近申請者が開発した染色体複製ドメイン構造を単一細胞で，かつゲノムワイドに調べることができるsingle-cell DNA replication sequencing(scRepli-seq）法を用いて，これまでアプローチが困難であった生体由来の個々の細胞における染色体構造制御を明らかにすることを目指している。昨年度に改良したプロトコール（蛍光標識したヌクレオチド類似体のFluorescein-dUTPを細胞に取り込ませてDNA合成期の細胞を標識し，マイクロマニピュレーターシステムを利用して複製中の一細胞を単離・回収する方法）を用い，実際のマウス胎児由来の細胞からscRepli-seqサンプルの調製を行った。予備的な結果として，培養細胞を使って得られた複製ドメインデータと同等のクオリティーのデータが得られることを確認しており，今後さらにサンプル数を増やして解析を進める予定である。Fluorescein-dUTPを用いたプロトコールの詳細は，論文として発表した（Miura et al. Nature Protocols 2020)。論文では，scRepli-seq法の実験手技の詳細だけでなく，得られたデータの解析パイプラインについても詳細に記述しており，今後多くの研究者がこの手法を利用することが期待される。一方で，より多くの単一細胞データの収集を可能にするため，scRepli-seqサンプル調製プロトコールの低コスト化についても検討した。具体的には，単一細胞から増幅によって得られたゲノムDNAをもとに次世代シーケンサー用ライブラリーを調製する試薬の種類や量などを再検討し，プロトコールの最適化を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度改良したプロトコールを用いて生体由来細胞から予備的なデータを取得し，良好な結果が得られている。サンプル調製（単一細胞からのゲノムDNAの増幅，増幅したDNAからライブラリー調製）プロトコールについてもさらに改良に成功し，安定な結果を得られ，同時にコストパフォーマンスの高いプロトコールを作成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後さらにサンプル数を増やして生体由来細胞における複製ドメイン構造の解析を進める。それにより，複製パターンが個々の細胞間でどれほど厳密に制御されているのかなど詳しく調べていく予定である。scRepli-seqの原理はゲノムコピー数解析を基本としていることから，個々の細胞における染色体異常解析への応用についても検討していく予定である。
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| Causes of Carryover |
初年度に引続き，所属機関の変更にともない研究環境が変化したため，支出内容が変わった。異動先での実験条件の再調整に使用する。
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