2020 Fiscal Year Research-status Report
高次ゲノム構造が織りなす複雑な遺伝子発現制御動態の解明
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19K06612
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
落合 博 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 講師 (60640753)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム構造 / 遺伝子発現 / 多能性幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、塩基配列上遠距離に位置するゲノム領域間の相互作用が遺伝子発現制御に関与していることが明らかとなってきた。マウス胚性幹(ES)細胞において多能性維持に重要な転写因子をコードするNanog遺伝子は相互作用するゲノム領域が多数且つ広範囲(30 Mb以上)に散在する、極めて特異な性質を有している。研究代表者の研究結果から、Nanogはプロモーター活性状態によってそれらゲノム領域との相互作用が大きく変化することが示唆されている。しかし、Nanogと相互作用する全てのゲノム領域が転写調節に関与するのか否か、またその相互作用と転写活性化の直接的な関係は依然として不明である。本研究では、マウスES細胞におけるNanogの転写活性化と相互作用領域との関係性を明らかにするために、sequential-FISHおよび独自に確立した特定遺伝子の核内局在および転写活性の可視化技術の改良法によって、遺伝子領域間相互作用と遺伝子発現の相関および動態を解析し、高次ゲノム構造動態と遺伝子発現制御の関係理解を目指す。
昨年度は、マウスES細胞におけるNanogの転写活性化と相互作用領域との関係性を明らかにするために、特定遺伝子の細胞核内局在と転写活性を高い精度で検出する技術の確立に取り掛かかり、以前確立した同様の手法(ROLEX system, Ochiai et al., NAR, 2015)に比べて、高いシグナルノイズ比で遺伝子領域および転写起点を可視化できるようになった。本年度は当該技術の検証を引き続き行うと共に、本技術を利用した転写動態と転写制御因子の局在の関係性を調べるために、各種細胞株の樹立を行った。また、sequential-FISH (Takei et al., Nature, 2021)を実施するための流路デバイスの構築と、必要なプローブの設計とプローブの作成を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、特定内在遺伝子の細胞核内局在と転写活性を高い精度で検出する技術(next-gen ROLEXシステム)をマウスES細胞のNanog等の遺伝子に適用し、同様の手法(ROLEX system, Ochiai et al., NAR, 2015)で観察されていた現象(非転写時の核内流動性が転写時のそれに比べて顕著に高い)が新技術でも観察されることを確認した。また、Oct4遺伝子にも適用し、ROLEXシステムと同様に、Oct4遺伝子ではそのような違いが認められないことを確認した。さらに、転写制御因子の局在と転写活性の関係性を調べるために、これら細胞株の転写制御因子コード遺伝子(RNA polymeraseやBrd4など)にSNAPtagをノックインした細胞株を樹立した。また、sequential-FISHを実施するための準備が完了した。このように、概ね順調に研究が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
next-gen ROLEXシステムをNanogおよびOct4に適用した細胞株に、さらに転写制御因子コード遺伝子にSNAP-tagをノックインした細胞株を樹立した。これまでに、転写遺伝子近傍に転写制御因子がクラスターを形成することを代表者らは見出している(Li et al., Cell, 2019)。しかし、以前の研究では非転写時にクラスターが近傍に存在するのか否かは不明であった。そこで、樹立した細胞を観察することにより、転写時だけでなく、非転写時において転写制御因子がクラスターを形成するか否かを解析し、転写制御機構の解明を目指す。また、sequential-DNA/RNA-FISHを実施する。具体的には、Nanog遺伝子近傍領域を標的として、上流下流30Mbの領域を120分割し、それぞれの領域を可視化できるようにプローブを作成した。また、対象領域内で顕著に発現する82遺伝子に対してRNA-FISH用のプローブを作成した。これらを利用して、DNA/RNA-FISHを実施し、遺伝子領域間相互作用と遺伝子発現の相関を解析し、高次ゲノム構造と遺伝子発現制御の関係理解を目指す。
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