2019 Fiscal Year Research-status Report
DNA損傷応答クランプ9-1-1の装着から脱装着までの反応ネットワークの解析
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19K06613
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
大橋 英治 九州大学, 理学研究院, 助教 (90378951)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | DNA損傷応答 / チェックポイント / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
9-1-1（Rad9-Hus1-Rad1）複合体は、Rad9、Hus1、Rad1から構成されるリング状のヘテロ三量体で、DNA損傷応答で多面的な役割を果たす。9-1-1は一本鎖DNAと二本鎖DNAの境界部を認識してDNAを囲む形でDNA上に装着（ローディング）され、DNA損傷後のチェックポイントシグナル伝達やDNA修復に機能すると考えられている。しかし、9-1-1複合体がDNAに装着された形で機能するという生化学的な証拠は示されていない。また、機能を果たした後の9-1-1が辿る過程も明らかになっていない。本研究では、9-1-1がDNAに装着されてから除去されるまでに起こる反応とその分子メカニズムを明らかにすることを目標とした。
本年度はまず、9-1-1の試験管内DNAローディング系の確立を試みた。環状の一本鎖DNAにビオチン修飾したオリゴDNAをアニーリングし、ビーズに固定してローディング反応の基質とした。これをアフリカツメガエルの卵核質抽出液（NPE）に加えたところ、NPE中に存在するカエルのRad9（xRad9）がそのDNAに結合し、チェックポイント活性化の指標となるxChk1がリン酸化された。またxRad9の抗体でNPE中のRad9を免疫除去すると、xChk1のリン酸化が減少することも確認できた。一方、末端を部分的に一本鎖にした線状DNAをNPEに加えた場合でも、xRad9のDNA結合とxChk1のリン酸化が検出されたが、この場合にはRad9を免疫除去してもxChk1のリン酸化はほとんど減少しなかった。これらのことから9-1-1がDNAに結合した時のチェックポイント活性化に対する貢献度はDNA基質により異なることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は9-1-1のDNAローディング系の確立を試み、ツメガエルNPE中の9-1-1の構成因子xRad9が一本鎖DNAと二本鎖DNAの境界部を持つDNAと結合することを確認した。また、この場合のチェックポイントの活性化には、DNA基質によりRad9依存的なものと非依存的なものがあることが分かった。これらの系を利用して、それぞれのDNA上で起こる反応を比較しつつ調べることが可能になった。しかしながら、カエルのRad9を免疫除去した状態で、ヒト由来の精製9-1-1を加えてもRad9依存的なチェックポイントシグナル（xChk1のリン酸化）は回復しなかったため、カエル由来の9-1-1を発現、精製する為にこれらをコードするcDNAを得て、発現系を構築している。保有していたヒト由来の精製9-1-1がカエルのNPE中で機能しなかったことは誤算ではあるが、その他の点については想定通りの結果と意外な結果の両方が得られており、順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで9-1-1はDNA損傷後に生じるDNAの二重鎖と一本鎖の境界を認識してローディングされ、DNA損傷応答に関わると考えられてきた。しかしながら本研究から少なくともチェックポイントの活性化に対するRad9の依存性がDNA基質により異なることが分かったため、この違いに着目してそれぞれの場合での9-1-1の役割について調べていきたい。オリゴヌクレオチドをアニーリングした環状DNAおよび末端を一本鎖にした線状DNAは、それぞれ複製阻害および二重鎖DNA切断を模していると考えられており、これらの状態から回復する際に必要な因子との関連性についても調べたい。
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Research Products
(2 results)
