複製新生鎖へのクロマチン形成機構の探索：AFMによる新生鎖クロマチンの可視化解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06614
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 日詰 光治 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10378846)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: DNA複製 / ヌクレオソーム / クロマチン / 原子間力顕微鏡 / AFM

Outline of Annual Research Achievements

DNAの複製に伴い、鋳型鎖コアヒストンをLeading鎖とLagging鎖へ分配する機構は、鋳型鎖と同様のクロマチン構造を両新生鎖に再形成するうえで重要である。本研究では、新生鎖へのヒストンローディングに機能していることが最近報告されたMcm2やDpb3-Dpb4などの複製関連因子のヒストンシャペロン活性の有無をin vitro で検証する。2019年度までに行った研究により、Mcm2 のアミノ末端領域や、Dpb3-Dpb4複合体について、これらの精製標品を用いた生化学的実験下においては、そのヒストンシャペロン活性を検出することができなかった。
本年度は、まず、昨年度まで実施していたMNase消化によるヌクレオソームの検出だけでなく、トポイソメラーゼアッセイやAFM観察による、ヌクレオソーム形成能の検定を行った。いずれの結果も、Mcm2 のアミノ末端領域、およびDpb3-Dpb4複合体の存在下で、ヌクレオソーム、あるいはヒストンH3-H4のみからなるテトラソームの形成は検出できなかった。
このことをふまえ、これらタンパク質が一般的に言われるしシャペロン活性をもたず、他の様式でヒストンやヌクレオソームと相互作用しているのではないかと考え、さらに以下の研究を行った。GST融合Mcm2部分タンパク質を用いたプルダウン実験から、当該タンパク質が、ヌクレオソームに対する結合はほぼ検出できないのに対し、コアヒストンに対しては結合する様子が検出された。また、ヒストンH2A-H2Bに対するよりも、ヒストンH3-H4に対して比較的強い結合能を示した。
上記のヒストン結合のメカニズムをより詳細に調査するため、Mcm2のアミノ末端領域のうち保存された残基のアラニン置換変異タンパク質の精製を行った。次年度は、この変異タンパク質との比較を実施しつつ、ヒストン結合能の生理的な意義を調査する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

新型コロナウイルスに関する移動の制限等から、当初予定していたAFM観察のための出張実験についてその実施回数を大幅に減らさざるを得なかった。そのため、実験計画にあった酵母から精製したミニ染色体のAFM可視化解析の実施を抑制的にして、その分、ヒストンシャペロン活性測定や複製因子とヒストンとの相互作用解析などの生化学実験に重点を置いて実施した。研究実施内容の優先順位は変更したが、初年度より順調に進んでいた生化学実験に重点を置くことで、効率的な研究の実施を進めている。

Strategy for Future Research Activity

当初検出を目指していた、複製因子タンパク質のヒストンシャペロン活性は検出できていないが、「Mcm2アミノ末端領域が、ヌクレオソームには結合しないが、ヒストンには結合する」という知見を得た。今後は、このヒストン結合の生理的意義を重点的に調査することを方策とし、そのため、下記の実験などをすすめる予定である。
まず、Mcm2とヒストンが結合を妨げているのは、ヌクレオソームのDNAのどの領域かを特定する。すなわち、ヌクレオソームを形成させるDNAを、146 bp よりも短いものを使うなどして、DNAの巻数が通常よりも少ないヌクレオソームを人工的に調整するなどし、Mcm2との結合を調査する。あるいは、ヘリカーゼにより部分的にヌクレオソームのDNAがヒストンから解離された状態を人工的に再現し、その状態でのMcm2とヒストンの結合を探索する。これにより、鋳型鎖のヒストンがMcm2により補足されうる状況の同定を行う。
また、Mcm2のアミノ末端領域を欠損した、変異CMGヘリカーゼを精製し、ヌクレオソームを形成した基質DNAについてヘリカーゼ活性を十分に発揮するかどうか、調査するなどする。
以上のような研究から、Mcm2アミノ末端のもつヒストン結合能の意義を探る。
また、Dpb3-Dpb4についても、2020年度までの本研究において実施した結果ではヌクレオソームとの結合能を見いだせていない。過去の文献によると、Dpb3-Dpb4はヒストン結合能を有するため、前述のMcm2と同様の解析に供し、その役割を探索する。

Causes of Carryover

執行率９９．２％と、ほぼ予定通り予算を執行した。11,038円の次年度使用額が発生したが、これは、次年度の生化学実験（より重点的に行うことを計画）の試薬の購入に充てる。