2020 Fiscal Year Research-status Report
Clarification of molecular basis for high mutation frequency induced by heavy ion beams
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19K06622
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
石井 公太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 仁科加速器科学研究センター, 協力研究員 (50632965)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
風間 裕介 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (80442945)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 重イオンビーム / DNA修復 / 線エネルギー付与 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重イオンビームは電離放射線の一種であり、高い線エネルギー付与(LET)をもち高頻度に変異を誘発する。研究代表者らはシロイヌナズナへの照射実験でLET = 30 keV/μmが最も変異率が高いことを発見した（至適LET）。至適LETでの照射当代での変異率は、LET = 22.5 keV/μm（低LET）での照射時の約2.5倍を示す。7.5 keV/μmのLETの差による変異率上昇はビームの物理的な作用では説明できない。研究代表者らは至適LETでの重イオンビーム照射時にRPA1E遺伝子が高発現することと、RPA1Eの機能欠損変異体では至適LET照射時の変異率が低LET照射時と同等となることを発見した。これらの結果から、RPA1Eの発現上昇によりDNA二重
鎖切断(DSB)部位へのRAD51のリクルートが阻害され、その結果誤りやすいDSB修復を促進させるという仮説を考案した。本研究では、至適LETと低LET照射時のDSB部位に結合するRAD51とPolθの量を比較し、また全ゲノム変異解析によりPolθを介したDSB修復の頻度を比較して本説を実証し、重イオンビームによる高頻度変異誘発の生物学的背景を明らかにする。2020年度は1) 2019年度に作製した複数のRPA1E過剰発現変異体から発現量の高い個体の選抜を行い、重イオンビーム照射後2世代目の種子を得た。2) 野生型シロイヌナズナの乾燥種子に低LETと至適LETでそれぞれ重イオンビームを照射し、照射2世代目の個体のゲノムDNA抽出を行った。3) 作製したPolθとRPA1Eのポリクローナル抗体の評価のため、重イオンビームを照射したシロイヌナズナ幼苗からのタンパク質抽出とウエスタンブロットを行う手法をRAD51抗体を用いて確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020年度は以下のように研究を行った。1) 2019年度に作製したRPA1E過剰発現変異体複数系統のうち、qPCRによってRPA1Eの発現が安定して高いものを選抜した。選抜した系統の乾燥種子に対して低LETと至適LETでそれぞれ重イオンビームを照射し、別個の照射当代9個体から次世代の種子を採取した。2) 低LETと至適LETの重イオンビームにより誘発される変異の特徴の差を明瞭にするため、新たにそれぞれのLETで重イオンビームを300 Gy照射し、別個の照射当代8個体から次世代の植物体を育成し、ゲノムDNAを抽出した。新型コロナウィルス蔓延による影響で年度当初の重イオンビーム照射が行えなかった。3) 重イオンビームを照射したシロイヌナズナ幼苗からタンパク質抽出とウエスタンブロットを行う手法を確立した。当初乾燥種子からのタンパク質抽出を試みたが、多量の貯蔵タンパク質が障害となった。新たな手法により、幼苗に対して50 Gyの重イオンビーム照射を行い、ウエスタンブロットによりRAD51の検出に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では大きく分けて2つの実験を行う。1) シロイヌナズナRPA1E遺伝子過剰発現変異体の作製と全ゲノム変異解析：低LETと至適LETの重イオンビームを照射した野生株の全ゲノム変異解析を行い変異スペクトルの差を明瞭にする。低LETと至適LETの重イオンビームを照射したRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノム変異解析を行い、どちらのLETで照射したRPA1E過剰発現変異体の変異スペクトルも至適LETの重イオンビームを照射した野生株に近似していることを確認する。2) 過剰RPAのDSB部位へのRAD51リクルート阻害能の測定：作製したシロイヌナズナのPolθとRPA1Eのペプチド抗体の評価をシロイヌナズナの幼苗を用いて行う。幼苗に低LETと至適LETそれぞれの条件で重イオンビームを照射し、抗RPA1E抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、RPA1Eの結合したクロマチンを回収する。回収したクロマチンに対して抗Polθ抗体と抗RAD51抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ない、DNAに結合しているRAD51タンパク質とPolθタンパク質の量を比較する。過剰なRPA存在下でのRAD51タンパク質のDSB部位への結合が阻害され、その結果Polθタンパク質がより多く結合するという仮説が正しければ、至適LET照射区では低LET照射区と比べてPolθの量が多く、RAD51の量が少ないという結果が得られるはずである。RPA1E過剰発現変異体に対して同様の実験を行なう。どちらのLET照射区でもPolθの量が多いと考えられる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルス蔓延による影響で年度当初の重イオンビーム照射が行えず、低LETと至適LETの重イオンビームにより誘発される変異の特徴の差を明瞭にするための全ゲノム変異解析が2021年度にずれ込んだ。低LETと至適LETの重イオンビームを照射したRPA1E遺伝子過剰発現変異体とともに全ゲノムシーケンスと変異解析を行う。
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