2021 Fiscal Year Research-status Report
Clarification of molecular basis for high mutation frequency induced by heavy ion beams
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19K06622
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| Research Institution | National Institutes for Quantum Science and Technology |
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Principal Investigator |
石井 公太郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命・医学部門 放射線医学研究所 計測・線量評価部, 主任研究員 (50632965)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
風間 裕介 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (80442945)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 重イオンビーム / DNA修復 / 線エネルギー付与 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重イオンビームは電離放射線の一種であり、高い線エネルギー付与(LET)をもち高頻度に変異を誘発する。研究代表者らはシロイヌナズナへの照射実験でLET = 30 keV/μmが最も変異率が高いことを発見した（至適LET）。至適LETでの照射当代での変異率は、LET = 22.5 keV/μm（低LET）での照射時の約2.5倍を示す。7.5 keV/μmのLETの差による変異率上昇はビームの物理的な作用では説明できない。研究代表者らは至適LETでの重イオンビーム照射時にRPA1E遺伝子が高発現することと、RPA1Eの機能欠損変異体では至適LET照射時の変異率が低LET照射時と同等となることを発見した。これらの結果から、RPA1Eの発現上昇によりDNA二重
鎖切断(DSB)部位へのRAD51のリクルートが阻害され、その結果誤りやすいDSB修復を促進させるという仮説を考案した。本研究では、至適LETと低LET照射時のDSB部位に結合するRAD51とPolθの量を比較し、また全ゲノム変異解析によりPolθを介したDSB修復の頻度を比較して本説を実証し、重イオンビームによる高頻度変異誘発の生物学的背景を明らかにする。令和3年度は 1)令和2年度に野生型シロイヌナズナの乾燥種子に低LETと至適LETでそれぞれ重イオンビームを照射して得た、照射2世代目の全ゲノム変異解析を行い、変異の数・大きさ・種類を含めた変異スペクトラムを明らかにした。2)令和2年度にRPA1E過剰発現変異体にそれぞれのLETで重イオンビーム照射して得た、照射2世代目のゲノムシーケンスを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウィルスの蔓延による影響、また研究代表者の異動に伴い本研究課題に関する実験を行うための事務手続きが必要であったことから重イオンビーム照射等の実験が行えず、本研究課題の進捗はやや遅れている。令和3年度は以下のように研究を行った。1) 低LETと至適LETの重イオンビームにより誘発される変異の特徴の差を明瞭にするため、令和2年度に新たに野生株の種子にそれぞれのLETで重イオンビームを300 Gy照射して得ていた照射2世代目8個体ずつの全ゲノムシーケンスと変異解析を行った。2) 令和2年度にRPA1E過剰発現変異体の乾燥種子に対して低LETと至適LETでそれぞれ重イオンビームを照射して得ていた照射2世代目の種子を育成し、8個体ずつの全ゲノムシーケンスを行った。3) 野生株の幼苗に対して低LETと至適LETの重イオンビームを照射し、タンパク質の発現量解析のために植物体を凍結保存した。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度は大きく分けて2つの実験を行う。1) シロイヌナズナRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノム変異解析：低LETと至適LETの重イオンビームを照射したRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノム変異解析を行い、どちらのLETで照射したRPA1E過剰発現変異体の変異スペクトルも至適LETの重イオンビームを照射した野生株に近似していることを確認する。
2) 過剰RPAのDSB部位へのRAD51リクルート阻害能の測定：作製したシロイヌナズナのPolθとRPA1Eのペプチド抗体の評価をシロイヌナズナの幼苗を用いて行う。幼苗に低LETと至適LETそれぞれの条件で重イオンビームを照射し、抗RPA1E抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、RPA1Eの結合したクロマチンを回収する。回収したクロマチンに対して抗Polθ抗体と抗RAD51抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ない、DNAに結合しているRAD51タンパク質とPolθタンパク質の量を比較する。過剰なRPA存在下でのRAD51タンパク質のDSB部位への結合が阻害され、その結果Polθタンパク質がより多く結合するという仮説が正しければ、至適LET照射区では低LET照射区と比べてPolθの量が多く、RAD51の量が少ないという結果が得られるはずである。RPA1E過剰発現変異体に対して同様の実験を行な
う。どちらのLET照射区でもPolθの量が多いと考えられる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの蔓延による影響、また研究代表者の異動に伴い本研究課題に関する実験を行うための事務手続きが必要であったことから、補助事業を延長し令和4年度に過剰RPAのDSB部位へのRAD51リクルート阻害能の測定を行う。また、野生株における低LETと至適LETの重イオンビームにより誘発される変異の特徴の比較結果を参考に、RPA1E過剰発現変異体のシーケンス解析個体を十分量に追加して行う予定である。
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