2022 Fiscal Year Research-status Report
Clarification of molecular basis for high mutation frequency induced by heavy ion beams
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19K06622
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| Research Institution | National Institutes for Quantum Science and Technology |
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Principal Investigator |
石井 公太郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学研究所 計測・線量評価部, 主任研究員 (50632965)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
風間 裕介 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (80442945)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 重イオンビーム / DNA修復 / 線エネルギー付与 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重イオンビームは電離放射線の一種であり、高い線エネルギー付与(LET)をもち高頻度に変異を誘発する。研究代表者らはシロイヌナズナへの照射実験でLET = 30 keV/μmが最も変異率が高いことを発見した（至適LET）。至適LETでの照射当代での変異率は、LET = 22.5 keV/μm（低LET）での照射時の約2.5倍を示す。7.5 keV/μmのLETの差による変異率上昇はビームの物理的な作用では説明できない。研究代表者らは至適LETでの重イオンビーム照射時にRPA1E遺伝子が高発現することと、RPA1Eの機能欠損変異体では至適LET照射時の変異率が低LET照射時と同等となることを発見した。これらの結果から、RPA1Eの発現上昇によりDNA二重
鎖切断(DSB)部位へのRAD51のリクルートが阻害され、その結果誤りやすいDSB修復を促進させるという仮説を考案した。本研究では、至適LETと低LET照射時のDSB部位に結合するRAD51とPolθの量を比較し、また全ゲノム変異解析によりPolθを介したDSB修復の頻度を比較して本説を実証し、重イオンビームによる高頻度変異誘発の生物学的背景を明らかにする。
令和4年度は、前年度までに得られていたRPA1E過剰発現変異体に至適LETと低LETそれぞれのL重イオンビームを照射した2世代目のゲノムシーケンスデータについて全ゲノム変異解析を行い、変異の数・大きさ・種類を含めた変異スペクトラムを明らかにした。それぞれの系統において、変異スペクトラムが、野生株に対して至適LETの重イオンビームを照射した場合に近いことがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和4年度に遂行する予定であった2つの実験のうち、1) シロイヌナズナRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノム変異解析については、低LETと至適LETの重イオンビームを照射した2世代目のRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノム変異解析を行った。それぞれの系統において、検出された全変異に対して100 bp以上の大規模変異の占める割合が、野生株に対して至適LETの重イオンビームを照射した場合に近いことがわかった。一方、2) 過剰RPAのDSB部位へのRAD51リクルート阻害能の測定については、新型コロナウィルスの蔓延による影響を受け、実験を完了することができなかった。令和5年度に引き続き実験を遂行する。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度は2つの実験を行う。1) シロイヌナズナRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノム変異解析：個体ごとの変異スペクトルのばらつきが大きかったため、低LETと至適LETの重イオンビームを照射したRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノム変異解析を追加して行い、変異スペクトラムの傾向をより明瞭に明らかにする。2) 過剰RPAのDSB部位へのRAD51リクルート阻害能の測定：作製したシロイヌナズナのPolθとRPA1Eのペプチド抗体の評価をシロイヌナズナの幼苗を用いて行う。昨年度までに幼苗に低LETと至適LETそれぞれの条件で重イオンビームを照射した。令和5年度は抗RPA1E抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、RPA1Eの結合したクロマチンを回収する。回収したクロマチンに対して抗Polθ抗体と抗RAD51抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ない、DNAに結合しているRAD51タンパク質とPolθタンパク質の量を比較する。過剰なRPA存在下でのRAD51タンパク質のDSB部位への結合が阻害され、その結果Polθタンパク質がより多く結合するという仮説が正しければ、至適LET照射区では低LET照射区と比べてPolθの量が多く、RAD51の量が少ないという結果が得られるはずである。RPA1E過剰発現変異体に対して同様の実験を行なう。どちらのLET照射区でもPolθの量が多いと考えられる。
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| Causes of Carryover |
令和4年度に行う予定であった実験：過剰RPAのDSB部位へのRAD51リクルート阻害能の測定の一部が、新型コロナウィルスの蔓延による影響により行えなかったため次年度使用額が生じた。令和5年度に行う生化学実験のための試薬類を購入する。また、ゲノムリシーケンスの一部は内部予算で行ったゲノムシーケンスに相乗りするかたちで行ったため、次年度使用額が生じた。低LETと至適LETの重イオンビームを照射したRPA1E遺伝子過剰発現変異体の全ゲノムシーケンシングならびに変異解析を追加して行い、変異スペクトラムの傾向をより明瞭に明らかにする。
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