2020 Fiscal Year Research-status Report
強力な直接遺伝学を駆使して微生物走性システムの全貌を見る
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19K06627
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 准教授 (90223297)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 次世代ゲノムライブラリー作成 / ゲノム解析 / 好塩性古細菌 / UV照射 / 突然変異 / 微生物 / 好アルカリ性古細菌 / 走性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和２年度は、高度好塩性好アルカリ性古細菌ナトロノモナスを使用したUV照射変異実験を中心にプレート単位での大量培養、ゲノムDNA抽出とゲノムシーケンス解析を行った。
UV照射実験では、照射位置におけるUV線量を正確に測定する目的で、UV照射光（クロスリンカーのUV蛍光管を１本に減らして使用）が安定化した後に、リモートで開閉する装置を作成した。この際に、UV変異を導入する菌懸濁液のセット位置付近にUV線量計を設置して、実際に照射したUV線量をエネルギー量（J/m2）として確認できるように工夫した。この装置を使って、未照射群（UV照射装置に入れて１分ほどおいたが、蓋を開かなかった試料）と大まかに３段階の異なるエネルギー群（15, 50, 100 J/m2）に分けて照射する実験を独立して30回程度繰り返し行った。４つの群それぞれから90サンプルをランダムに抽出して、合計360サンプルからゲノムライブラリー調製を行った。ここでは、96のディープウェル用の振盪培養装置（一昨年導入）使って効率的に培養すると同時に、効率的な培養液の量と振盪条件に工夫を行った。それに続くゲノムDNA調製も、96プレートのまま進められるプロトコルを更にチューニングした。さらに、昨年度に工夫したビーズ上でタグメンテーションを行うライブラリー調製法を96プレート単位で行ことで、効率的な大量ライブラリー調製方法が完成した。ゲノムDNAの段階とライブラリー作成の最後の段階で96サンプルすべてにおいて、そのDNA量をサイバーグリーンによる蛍光法で定量し、最後のライブラリーはキャピラリーシーケンサーを使用してDNAのサイズ分布も調べた。シーケンス結果は、まだ戻ってきていないので、解析できていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和２年度は、新型コロナウイルス感染防止対策による学生、研究員の実験制限による遅延と、申請者のエフォートの変化（リモート授業準備など）の影響が大きく出て、細かいトラブルシューティングに対して、迅速な対応ができなかった。また、経費節減のためシーケンス解析を外注しているが、サンプル輸送に関する時間が、これまでより長くかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定の順序とは逆になるが、まず好塩性古細菌の変異体を大量に作成し、そのゲノム構造を1000株ほど決める作業を続けると同時に、続いて真正細菌（Vibrio)のUV変異導入ーゲノム解析の実験を行う。余裕があれば、真核微生物（Schizosaccharomyces pombe)も比較対象に加えたい。
また、作成した変異体を保存する方法（グリセロール冷凍保管）を工夫すると同時に、すべての作成した古細菌変異株の走性に関するスクリーニング実験を行う。さらに、スクリーニング方法を工夫して、いくつかの表現型（抗生物質耐性、栄養要求性、窒素飢餓応答等）に対して、作成した同じ変異体ライブラリー（1000クローン）を使ってスクリーニングし、ゲノムシーケンス配列と直結した絞り込み作業を行う。これによって、それぞれの表現型が持つシステムサイズを見積もる。この段階では、各表現型の詳細には入り込まず、1000種類程度のランダム変異体ライブラリー（平均、10箇所程度に変異を持つ）のスクリーニング効率を検証することを第一目標にする。また、リソースの保存方法にも注意を払い、-80℃での保存でどの程度再生してくるのか？についても半年から１年ごとに調べ、これに関してもゲノム変異との相関を見る。
ビーズ上で行うタグメンテーション法は、市販の試薬を準用しているが、これにコストがかかる。そのため、大腸菌で発現したTn5トランスポゼース（ここまでは構築済み）をアビジンビーズ上に固定化する作業までを自作しようと計画に加えた。現在、１サンプルのゲノム解析にトータル1200円程度かかっているが、この作業によって500円以下にできるので、少し回り道してでも自作Tn5-ビーズでのタグメンテーションライブラリー法を作成して、大量変異導入システム解析の基盤を作りたい。変異体リストは、データベース化し、公開する予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス流行のため、学会発表がことごとく中止またはリモート形式となり、旅費分など次年度に繰り越した。また、シーケンス外注も年度末ギリギリだったため、処理が次年度に繰り越しになったため。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Loss of cell wall integrity genes cpxA and mrcB causes flocculation in Escherichia coli2021
Author(s)
Sugawara Keita, Toyoda Hayato, Kimura Mami, Hayasaka Shunsuke, Saito Hiromi, Kobayashi Hiroshi, Ihara Kunio, Ida Tomoaki, Akaike Takaaki, Ando Eiji, Hyodo Mamoru, Hayakawa Yoshihiro, Hamamoto Shin, Uozumi Nobuyuki
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Journal Title
BIOCHEMICAL JOURNAL
Volume: 478
Pages: 41-59
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Presynaptic MAST kinase controls opposing postsynaptic responses to convey stimulus valence in Caenorhabditis elegans.2020
Author(s)
Shunji Nakano, Muneki Ikeda, Yuki Tsukada, Xianfeng Fei, Takamasa Suzuki, Yusuke Niino, Rhea Ahluwalia, Ayana Sano, Rumi Kondo, Kunio Ihara, Atsushi Miyawaki, Koichi Hashimoto, Tetsuya Higashiyama, Ikue Mori
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Volume: 117
Pages: 1638-1647
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Haloarcula mannanilytica sp. nov., a galactomannan-degrading haloarchaeon isolated from commercial salt2020
Author(s)
Enomoto Shigeaki, Shimane Yasuhiro, Ihara Kunio, Kamekura Masahiro, Itoh Takashi, Ohkuma Moriya, Takahashi--Ando Naoko, Fukushima Yasumasa, Yoshida Yasuhiko, Usami Ron, Takai Ken, Minegishi Hiroaki
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Journal Title
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY
Volume: 70
Pages: 6331-6337
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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