2021 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of the mechanism that determines cilia localization of G protein-coupled receptors
| Project/Area Number |
19K06636
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
三好 耕 大阪大学, 連合小児発達学研究科, 助教 (90362996)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | Ｇ蛋白質共役型受容体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、繊毛に局在するＧ蛋白質共役型受容体の一つであるセロトニン６型受容体のカルボキシル末端内のCilia Targeting Sequenceを含む領域と結合する蛋白質を探索するために行った酵母two-hybridスクリーニングにより得られた陽性クローンがコードする蛋白質について、哺乳類細胞におけるセロトニン６型受容体との結合を確認するための実験の残りを行った。陽性クローンおよびセロトニン６型受容体のcDNAの翻訳領域にタグ配列を付加したものを哺乳類細胞用発現プラスミドベクターに挿入し、これらをヒト胎児腎細胞由来の培養細胞であるHEK293T細胞に導入し、陽性クローンがコードする蛋白質とセロトニン６型受容体とのHEK293T細胞内での結合を、タグ抗体を用いた免疫沈降法・ウエスタンブロッティング法により検証した。
また、正常２倍体の染色体数を持つヒト網膜色素上皮細胞由来の培養細胞であるhTERT-RPE1細胞に対してゲノム編集技術Crispr/Cas9を用いることにより作製した陽性クローンの遺伝子の機能が破壊されたノックアウト細胞株およびコントロールhTERT-RPE1細胞に、タグを付加したセロトニン６型受容体を発現させ、受容体の繊毛局在の様式をタグ抗体、アセチル化チューブリン抗体を用いた免疫蛍光染色により観察し、ノックアウト細胞・コントロール細胞間で比較した。
これらの実験を通して、Ｇ蛋白質共役型受容体の１次繊毛への局在に対する、陽性クローンがコードする蛋白質の関与について検討した。
|
